关键词:
骨钙素
阿尔茨海默病
Tau过度磷酸化
细胞凋亡
AKT/mTOR
摘要:
目的探讨骨钙素(Osteocalcin,OCN)对阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)细胞模型的神经保护作用和潜在机制,为寻找治疗AD新靶点提供科学依据。方法利用40 nmol/L冈田酸(Okada acid,OA)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)处理24 h以构建AD细胞模型,把细胞分成正常组(未干预SH-SY5Y细胞)、模型组(40 nmol/L OA干预)和OCN干预组(不同浓度OCN干预,AD细胞模型),在AD模型细胞敲除/过表达AKT分为AKT-KO(3μg/μL)组、AKT-OE(3μg/μL)组和OCN干预后的AKT-KO+OCN组、AKT-OE+OCN组。采用CCK-8法检测AD模型细胞存活率变化;瑞氏染色观察AD模型细胞形态变化;Western blot法检测Tau、p-Tau、Bax、Bcl-2、Caspase-3及其裂解型,以及AD模型细胞敲除/过表达后各组Tau、p-Tau、mTOR、AKT、p-AKT的蛋白表达量变化;利用TUNEL染色法及流式细胞仪检测OCN干预AD细胞模型的早晚期凋亡细胞和凋亡率的变化。结果①与正常组相比,模型组的细胞存活率显著降低,形态和结构明显受损,p-Tau及Caspase-3蛋白表达量上调,早晚期凋亡增加,细胞凋亡率明显提高(P<0.05)。②与AD模型细胞组相比,不同浓度的OCN处理24 h后,细胞存活率均有不同程度的提高,其中100 pg/mL OCN组的存活率明显提高(P<0.01),细胞数量、形态明显改善(P<0.01)。③与AD细胞模型组相比,不同浓度OCN组p-Tau/Tau比值减少,尤其在100 pg/mL OCN干预组中,p-Tau/Tau的比值显著低于模型组(P<0.01)。④与模型组相比,在OCN浓度处于1~100 pg/mL时,Cleaved Caspase-3/Caspase-3的比值出现浓度依赖性的显著降低的情况,100 pg/mL Bax/Bcl-2的比值显著降低(P<0.0001)。⑤TUNEL染色及流式细胞仪结果显示,与模型组相比,各浓度OCN均能有效抑制AD模型细胞的凋亡程度,100 pg/mLOCN组的早晚期凋亡细胞和凋亡率明显减少。⑥与对照组和模型组相比,AKT过表达后,AKT-OE组的P-AKT显著上升(P<0.05);而使用AKT通路敲除后AKT-KO组的AKT蛋白表达水平下降(P<0.05);细胞内的p-Tau表达随着AKT/mTOR通路的改变而变化,当AKT通路受抑制时,AKT-KO组细胞内p-Tau表达水平与对照组相比高于模型组(P<0.05),当AKT过表达后,细胞内p-Tau表达水平明显被抑制(P<0.05)。结论OCN可能通过调节Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2的比值来抑制细胞凋亡、减少p-Tau蛋白表达从而改善AD模型细胞形态,有效保护神经细胞,其机制可能与调节AKT/mTOR通路相关。