关键词:
Bac-to-Bac TOPO系统
流感病毒
核蛋白
免疫原性
杆状病毒
昆虫细胞
摘要:
目的采用Bac-to-Bac TOPO系统表达甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP),并评价其免疫原性,以期为流感病毒NP疫苗的研究奠定基础。方法PCR法扩增甲型H1N1(A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019_CNIC-1909)流感病毒NP基因,连接至载体pFastBac^(TM)/CT-TOPO^(TM),转化感受态*** One Shot^(TM) Mach1^(TM) T1R,制备供体质粒,进行PCR及测序鉴定;将供体质粒转化感受态*** MAX Efficiency^(TM) DH10Bac^(TM),通过蓝白斑筛选阳性单克隆,提取重组杆粒,进行PCR鉴定。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒,流式细胞术检测病毒滴度。重组杆状病毒经多轮增殖后感染Sf9细胞,获得重组NP,并进行镍离子亲和层析纯化。将重组NP及PBS经皮下分别接种雌性BALB/c小鼠,每组6只,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体水平,流式细胞术检测小鼠脾细胞分泌IFNγ水平,酶联免疫斑点法检测小鼠脾细胞产生CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞水平。末次免疫后2周,用A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019_CNIC-1909流感病毒经小鼠鼻腔进行攻毒,监测攻毒后14 d内小鼠体质量变化及存活情况。结果PCR及测序鉴定结果证明,供体质粒构建正确;PCR鉴定结果证明,重组杆粒构建成功。重组杆状病毒滴度为2.875×10^(8) ivp/mL。重组NP可与鼠抗甲型流感病毒NP单克隆抗体发生特异性结合,纯化后纯度达91.3%。末次免疫后2周,与PBS组比较,NA组小鼠血清特异性抗体滴度(t=0.288,P<0.0001)、小鼠脾细胞产生IFNγ斑点平均数(t=9.235,P<0.0001)、产生CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞数量(t分别为10.870和6.200,P分别为0.0084和0.0250)均明显升高。PBS组小鼠感染病毒5 d后均死亡;NP组小鼠感染病毒5 d后死亡1只,剩余5只小鼠体质量下降但均存活。结论Bac-to-Bac TOPO系统表达的甲型流感病毒NP具有较高的免疫原性,能产生较强的体液和细胞免疫反应,可为小鼠抵御流感病毒感染提供一定的保护。