关键词:
亚砷酸钠
含纤维连接蛋白Ⅲ型结构域3B蛋白
细胞凋亡
P53通路
泛素化
摘要:
[背景]砷暴露引起细胞凋亡。含纤维连接蛋白Ⅲ型结构域3B蛋白基因(FNDC3B)可促进癌细胞增殖,但其在砷的致凋亡中尚未研究。[目的]探讨亚砷酸钠(NaAsO_(2))及其代谢产物对A549细胞中FNDC3B基因表达的影响以及了解FNDC3B基因在A549细胞中的功能。[方法](1)A549细胞暴露于不同终浓度的NaAsO_(2)中,48 h后通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测450 nm波长处的光密度值,绘制存活率曲线,根据存活率选择最终的暴露剂量。使A549细胞暴露于高浓度(30μmol·L^(-1))、中浓度(20μmol·L^(-1))、低浓度(10μmol·L^(-1))NaAsO_(2)、高浓度(30μmol·L^(-1))一甲基胂酸(MMA)、高浓度(30μmol·L^(-1))二甲基胂酸(DMA)48 h后提取总蛋白和RNA,采用定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(WB)检测FNDC3B基因的mRNA表达和蛋白表达情况,采用免疫共沉淀(CO-IP)和WB实验检测FNDC3B蛋白泛素化表达情况。(2)采用siRNA干扰方法敲低A549细胞中FNDC3B基因的表达。si-FNDC3B片段转染A549细胞48 h后,采用qRT-PCR和WB法检测FNDC3B基因的mRNA和蛋白的表达情况,利用CCK-8实验检测细胞活力,Hoechest33342/碘化丙啶(PI)双重染色法和JC-1线粒体膜电位实验检测细胞早期及晚期凋亡情况,WB检测cleaved caspase3蛋白和P53信号通路相关蛋白表达。[结果](1)CCK-8结果发现随着NaAsO_(2)浓度的增加,A549细胞活力下降,半数抑制浓度为38.12μmol·L^(-1)。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,不同浓度NaAsO_(2)(10、20和30μmol·L^(-1))均显著升高FNDC3B基因的mRNA表达(P<0.01),MMA和DMA对FNDC3B基因的mRNA表达影响差异无统计学意义(P>0.05);WB结果显示,与对照组相比,NaAsO_(2)处理组FNDC3B基因的蛋白表达下降,FNDC3B蛋白泛素化表达水平升高,FNDC3B蛋白泛素化K48位点泛素化表达水平升高;MMA和DMA对FNDC3B基因的蛋白表达无影响。(2)特异性敲低A549细胞中FNDC3B的表达后,CCK-8实验显示与对照组相比,沉默FNDC3B组(si-FNDC3B组)细胞活力显著降低;JC-1结果显示si-FNDC3B组线粒体膜电位低于对照组;Hoechst33342/PI染色实验结果显示si-FNDC3B组细胞呈现出明显的凋亡。WB结果显示,与对照组比较,si-FNDC3B组cleaved caspase3、P53、MDM2、Bad、Bax蛋白相对表达上升。[结论]NaAsO_(2)促进FNDC3B蛋白泛素化的表达,进而降低FNDC3B蛋白的表达,但其主要代谢产物DMA和MMA对FNDC3B蛋白表达无影响;沉默FNDC3B后抑制A549细胞的活力和促进细胞的凋亡,该现象与激活P53信号通路有关。