关键词:
外泌体
胆道闭锁
DNA甲基化
微RNA
摘要:
目的探讨过表达miRNA‑29b‑3p的外泌体通过DNA甲基化调控细胞上皮‑间充质转化,继而参与胆道闭锁(biliary atresia,BA)肝纤维化的发病机制。方法收集2018年12月至2021年12月就诊于遵义医科大学附属医院的30例4月龄以内的BA患儿和30例年龄匹配的非BA先天性胆总管囊肿(congenital choledochus cyst,CCC)患儿的外周血及病理检查后剩余肝组织,实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测BA患儿和CCC患儿外周血和肝组织中miRNA‑29b‑3p表达和DNA甲基化水平。使用慢病毒感染人白血病细胞系(Jurkat细胞),获得miRNA‑29b‑3p模拟物以及阴性空载对照的稳转株。将感染后未经处理的细胞作为空白对照组,过表达miRNA‑29b‑3p慢病毒与细胞共培养后作为miR‑29b‑3p外泌体组,正常外泌体与细胞共培养后作为外泌体组,空载对照慢病毒与细胞共培养后作为阴性外泌体组,使用5‑氮杂胞苷(5‑azacytidine,5‑AzaC)抑制后的细胞作为5‑AzaC组。将每组细胞的外泌体分别与人正常肝细胞系(L02细胞)共培养24 h。通过双荧光素酶报告系统鉴定miRNA‑29b‑3p的靶基因。检测各组L02细胞中miRNA‑29b‑3p、DNA甲基化酶(DNA methylase,DNMT)3a、DNMT3b、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,cleaved caspase‑3)、B淋巴细胞瘤‑2相关X蛋白(B lymphocytoma‑2 related X protein,Bax)、p21、Ki‑67、增殖细胞核抗原的mRNA及蛋白质表达水平,检测各组细胞中转录因子Snail、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和α‑平滑肌肌动蛋白(α‑smooth muscle actin,α‑SMA)的DNA启动子区CpG岛甲基化水平。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果PCR检测发现,BA患儿外泌体中miRNA‑29b‑3p相对表达水平为7.64±0.49,明显高于CCC患儿外泌体的1.00±0.04(t=13.59,P=0.016);BA患儿肝组织中miRNA‑29b‑3p相对表达水平为5.65±0.46,明显高于CCC患儿肝组织的1.00±0.05(t=9.90,P=0.041)。与外泌体组、空白对照组、阴性外泌体组相比,miR‑29b‑3p外泌体组的miRNA‑29b‑3p表达均高于其他组,miR‑29b‑3p外泌体组的DNMT3a、DNMT3b的mRNA、蛋白质表达均低于其他组(均P<0.05)。miRNA‑29b‑3p外泌体组cleaved caspase‑3、Bax蛋白表达水平高于空白对照组、阴性外泌体组,miRNA‑29b‑3p外泌体组Ki‑67蛋白表达水平低于空白对照组、阴性外泌体组(均P<0.05)。双荧光素酶实验显示,DNMT3a、DNMT3b是miRNA‑29b‑3p的直接靶标。加入miRNA‑29b‑3p模拟物或通过5‑AzaC抑制甲基化水平后,FN、Snail、α‑SMA的蛋白水平和mRNA水平均上调(均P<0.05)。甲基化检测结果表明,在L02细胞中,miR‑29b‑3p外泌体组与空白对照组、外泌体组以及阴性外泌体组相比Snail、FN启动子区DNA甲基化水平降低(均P<0.05),α‑SMA启动子区甲基化水平升高,加入5‑AzaC后Snail、FN启动子区DNA甲基化水平进一步降低(均P<0.05)。结论BA患儿外周血外泌体中miRNA‑29b‑3p高表达,过表达miRNA‑29b‑3p的外泌体使肝细胞Snail、FN的DNA启动子区低甲基化,促使Snail、FN高表达,从而发生细胞上皮‑间充质转化,进一步导致α‑SMA表达增高,可能加速了BA纤维化的进展。