关键词:
双氢青蒿素(DHA)
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)
抗病毒作用
细胞凋亡
摘要:
【目的】探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)作用。【方法】试验首先建立体外抗PRRSV的Marc-145细胞模型,采用MTT法检测DHA对Marc-145细胞毒性,确定其最大安全浓度。将Marc-145细胞分为4组,分别为空白对照组(Control)、阳性对照组(利巴韦林)、模型组(PRRSV)和药物组(DHA),检测阻断、抑制和直接灭活作用方式下DHA抗PRRSV的作用效果。通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测不同作用方式下、不同时间点PRRSV N的mRNA和蛋白表达量,利用Annexin/PI双染法检测PRRSV感染诱导的细胞凋亡情况。【结果】DHA和阳性药物利巴韦林的最大安全浓度分别为3.13和15.63μg/mL。在阻断、抑制和直接灭活作用下,DHA对PRRSV的的最大抑制率分别为66.2%、88.9%和62.1%;在抑制作用下细胞基本保持单层完好,在阻断和直接灭活作用下细胞出现了圆缩、团聚的现象。抑制作用下,利巴韦林对PRRSV的抑制率最大,抑制率为68.9%,细胞出现了圆缩、团聚的现象。实时荧光定量PCR检测结果显示,在阻断和抑制作用下,与模型组相比,利巴韦林和DHA组细胞中PRRSV N基因拷贝数显著降低(P<0.05);在直接灭活作用下,与模型组相比,DHA组细胞中PRRSV N基因拷贝数显著降低(P<0.05)。Western blotting结果显示,不同作用方式下,与模型组相比,不同时间点DHA组细胞中PRRSV N蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。细胞凋亡检测结果显示,阻断作用下,与模型组相比,早期凋亡48 h时,DHA组细胞凋亡率显著降低(P<0.05);晚期凋亡不同时间点,利巴韦林和DHA组细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。抑制作用下,与模型组相比,在早期凋亡和晚期凋亡72 h时,DHA组细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。直接灭活作用下,与模型组相比,早期凋亡24、48 h时,DHA组细胞凋亡率显著降低(P<0.05);晚期凋亡24、72 h时,DHA组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。【结论】DHA体外抗PRRSV作用显著,主要通过抑制PRRSV N基因表达及N蛋白合成发挥作用,同时对细胞凋亡具有抑制效果。