关键词:
丝素蛋白
纳米羟基磷灰石
氧化石墨烯
定向孔隙结构
生物活性骨再生
摘要:
目的:支架材料作为细胞和生长因子的重要载体,在骨组织工程领域引起了广泛的关注,但如何构建兼具成分与结构双重优势的支架材料仍然是一个挑战。本研究通过使用定向温度场冻结-干燥技术制备了丝素蛋白(Silk Fibroin,SF)/纳米羟基磷灰石(nanoHydroxyapatite,nHAp)/氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)定向孔道多孔支架,系统研究了定向多孔支架的表征、形貌、降解率、生物相容性和生物活性,并与传统无序海绵样SF多孔支架、SF/nHAp多孔支架和SF/nHAp/GO多孔支架相比较,从材料组成和结构设计上为牙科、骨科等定向孔道支架材料的进一步研究提供了有意义的参考。方法:(1)基于定向孔道结构的SF/nHAp/GO多孔支架的制备及理化性能的研究本研究通过采用冷冻-干燥技术和定向温度场冻结-干燥技术制备了传统无序海绵样SF、SF/nHAp、SF/nHAp/GO多孔支架和基于定向孔道结构的SF/nHAp/GO多孔支架材料,通过场发射扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)测试对各组支架的形貌、孔径、孔隙率进行表征和比较;利用含有1U/ml蛋白酶XIV的PBS溶液测试各组支架的体外降解能力;为了评价支架的体外矿化能力,将各组支架高温灭菌后浸泡于1.5×模拟体液(1.5×SBF)中,利用扫描电子显微镜(SEM)和傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)观察样品的表面形貌和元素组成。(2)基于定向孔道结构的SF/nHAp/GO多孔支架的体外细胞毒性、细胞相容性及成骨诱导的研究为了评价各组多孔支架材料的体外细胞毒性、细胞相容性、和成骨诱导能力,将复苏后的小鼠骨髓间充质干细胞(murine Bone marrow mesenchymal stem cells,m BMSCs),在各组多孔支架材料上培养,培养1、3、7 d,CCK-8法检测细胞毒性,通过活/死细胞染色(living/dead staining)和罗丹明标记鬼笔环肽-DAPI染色后,利用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察细胞的存活力和细胞增殖黏附能力。利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测多孔支架材料内部成骨相关基因的表达情况,包括ALP、Runx-2、OC、和Col-Ⅰ。(3)基于定向孔道结构的SF/nHAp/GO多孔支架对大鼠颅骨缺损修复实验研究随机挑选了24只雄性且健康的Sprague Dawle(标称SD)大鼠,分成两组,在大鼠的双侧颅骨上分别建立圆形缺损模型。Ⅰ组大鼠植入SF、SF/nHAp支架,Ⅱ组大鼠植入海绵样SF/nHAp/GO、定向孔道SF/nHAp/GO支架,实验动物在手术后6周、12周各处死12只,6周处死的大鼠在术后3周、4周、5周注射荧光标记,12周处死的大鼠在6周、8周、10周注射荧光标记,获得实验动物完整颅骨缺损骨块,拍摄X-射线照片(X-ray),在不同时间点观察各组大鼠骨缺损区的骨修复情况;随后制作非脱钙仅脱水的颅骨组织切片,在激光共聚焦显微镜下观察荧光染色标记情况;运用组织切片系列设备制作骨组织切片,通过HE、Masson染色,光学显微镜下观察骨细胞、炎症细胞情况;大鼠处死后,对其心、肝、脾、肾等内脏进行解剖,对其进行HE染色,对各器官细胞形态进行观察,对实验材料进行生物安全性评价。结果:1、基于定向孔道结构的SF/nHAp/GO多孔支架的制备及理化性能的研究表征结果表明,在多孔支架中SF、nHAp和GO没有出现明显的相分离情况,这说明三者组分具有很好的相容性。虽然nHAp和GO的加入在一定程度上降低了材料的孔径和孔隙率,但定向温度场冻结-干燥技术可以提高支架的孔径和孔隙率,使得定向孔道SF/nHAp/GO支架具有更好的孔隙连通性和更合适的孔隙率。降解实验显示,nHAp和GO在一定程度上增强了支架抵抗酶降解的能力,使得具有定向孔道的SF/nHAp/GO支架和SF/nHAp/GO支架具有一定匹配骨组织生成相应的降解速率。体外矿化实验结果显示,nHAp和GO的引入可以增加支架材料诱导类骨磷灰石的能力,有效提高促进成骨的能力。2、基于定向孔道结构的SF/nHAp/GO多孔复合支架的体外细胞毒性、细胞相容性及成骨诱导的研究细胞相容性实验结果表明,各组支架材料在一段时间内对细胞几乎没有不良影响,增加了nHAp和GO材料的支架细胞存活率与细胞形态均较好于纯SF支架,说明nHAp和GO均能促进细胞存活,且nHAp和GO对m BMSCs的增殖有更强的协同作用,细胞相容性更好。而增加了定向孔道的SF/nHAp/GO支架则得益于其独特的孔隙结构,使骨髓间充质干细胞的粘附与增殖更为有利。RT-PCR结果显示实验组各组