关键词:
石墨烯
壳聚糖
富血小板血浆
难愈合创面
摘要:
目的:难愈合创面的治疗是当代医学的难题,给患者带来巨大的痛苦和经济负担。血小板(Platelet)在止血、组织再生和宿主防御中起着至关重要的作用。活化的血小板释放α颗粒,其中含有多种生长因子、细胞因子和细胞外基质调节剂,可以促进受损组织的修复再生。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是一种由石墨氧化而来的单层片状结构的碳纳米材料,具有较强的光热转化作用以及一定的抗菌性。壳聚糖(chitosan,CS)是一种天然大分子多糖,具有较好的止血、抗菌以及促进增殖的能力。温度敏感的壳聚糖-β-甘油磷酸钠水凝胶会响应环境温度的改变,在室温(20-25℃)下呈液体状态,在体温(37℃)下迅速变为固态,便于注射上药,符合伤口形状。光热治疗(photothermal therapy,PTT)和光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)作为一种新兴的治疗方法,在抗肿瘤及抗菌等方面的疗效已被证实。本研究拟通过将氧化石墨烯以及光热治疗引入温敏壳聚糖血小板水凝胶,研究其光热效果、生物相容性和促修复作用,以期为难愈合皮肤创面患者的治疗提供新的思路。方法:1.制备温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶。首先,采用Hummers方法的制备并纯化氧化石墨烯,并利用透射电子显微镜(TEM)、拉曼光谱仪(Raman Spectrometer)、傅里叶红外光谱仪(FTIR)和X射线衍射(XRD)对其进行表征。接着,制备了氧化石墨烯/壳聚糖/β甘油磷酸/羟丙基纤维素四相温敏水凝胶体系。最后,通过离心法获得富血小板血浆,并加入温敏水凝胶,获得温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶。利用扫描电子显微镜(SEM)以及傅里叶红外光谱仪(FTIR)对合成的热敏氧化石墨烯血小板水凝胶进行表征,用流变仪测试其流变性能和可注射性,通过万能试验机研究其压缩性能,并通过测试水凝胶的p H、成胶时间、溶胀性能、抗菌性能及体外降解等指标,观察其性能特点。通过激光器测试其光热性能,并利用红外热成像仪记录整个实验过程的温度变化。2.温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶的体外生物学效果研究:通过CCK-8实验研究水凝胶对细胞活性的影响以及有无促增殖作用;通过细胞划痕实验研究水凝胶对L929细胞迁移作用的影响;使用钙黄绿素(Calcein)/碘化丙啶(PI)双染试剂盒研究用水凝胶浸出液培养的细胞的存活情况。3.温敏氧化石墨烯血小板水凝胶的体内生物学效果研究:采用8周龄的雄性SD大鼠建立感染皮肤创面模型,将水凝胶贴敷于大鼠皮肤创面并进行光热治疗,观察创面恢复情况。对于治疗后创面处新生的皮肤组织及肉芽组织进行HE染色,Masson染色和免疫组织化学染色,观察创面愈合过程中皮肤层的形态变化,组织胶原结构的增生情况以及抗炎因子和促炎因子的改变;对使用水凝胶的大鼠主要器官切片进行HE染色,评估其生物组织相容性。结果:***图像可见GO呈片层状分布;拉曼光谱显示,在1593 cm和1347 cm处存在两个由碳原子的SP2振动引起的对应于G和D波段的显著峰,即为GO的特征峰;XRD谱图显示在2θ=10°时存在一个尖峰,代表石墨的氧化,可表明其晶体性质;FTIR光谱中可见到氧化石墨烯薄片的剥落产生的大量的官能团,包括羰基、羧基和环氧基。以上实验结果均证明了GO的成功制备。此后,制备了温敏氧化石墨烯血小板水凝胶,并通过TEM观察其微观形貌呈疏松多孔状,通过流变仪证实其具有良好的流变性能和可注射性,万能试验机的测试证明其具有较好的抵抗压缩能力,在激光器照射下,利用红外热像仪观察到水凝胶具有良好的光热性能。根据p H、凝胶时间、溶胀性能、光热性能等方面评价,氧化石墨烯浓度为1.0mg/ml的水凝胶具有较好的综合性能,用于进行后续的体内外生物学研究。***8实验显示,温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶对细胞增殖未表现出明显的抑制作用,且有一定的促进作用;细胞划痕实验表明,温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶对细胞迁移有较明显的促进作用;钙黄绿素(Calcein)/碘化丙啶(PI)双染色实验表明,温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶对细胞无明显毒性作用。3.成功建立SD大鼠感染皮肤创面模型,应用水凝胶敷料后观察结果显示,温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶以及其联合光热治疗时,均具有一定促进感染创面愈合的效果。此外,温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶具有良好的生物相容性,未表现出明显的生物毒性。结论:本研究成功制备了温敏氧化石墨烯富血小板血浆水凝胶,并证实了其可以促进感染伤口的愈合,为治疗难愈合皮肤创面提供了新的思路。