关键词：
RP4质粒
抗生素抗性基因
枯草芽孢杆菌
氧化石墨烯
水稻
摘要：
近年来,抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes,ARGs）在生态系统中的传播备受关注。研究发现,众多材料对ARGs的富集和转移都存在影响。石墨烯作为新型材料,因其自身具有优异的性能而被广泛应用于各大领域。随着使用范围的扩大和使用量的提高,石墨烯将无可避免地进入环境。迄今为止,已有大量研究报道了石墨烯的潜在环境生态风险,包括对ARGs赋存、细菌和植物生理生态等各方面,但其对ARGs在宿主细菌之间的传递以及对植物富集ARGs的影响尚不清楚。本研究以携带RP4质粒的大肠杆菌D5Hɑ、枯草芽孢杆菌WB600和水稻作为研究对象,首先探究了氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）对RP4质粒介导的ARGs从革兰氏阴性菌转移至革兰氏阳性菌的影响和相关机制;在此基础上,进一步探究了GO对RP4质粒从根外向植物地上部迁移的影响及相关过程。本研究有望为GO对ARGs在“细菌—植物”体系内传播的影响提供必要的科学依据。目前,研究主要取得以下三方面的成果:（1）在25-400 mg LGO的作用下,RP4质粒介导的ARGs从革兰氏阴性菌—大肠杆菌DH5ɑ转移至革兰氏阳性菌—枯草芽孢杆菌WB600的接合转移频率显著上升。PCR和凝胶电泳实验证实了RP4质粒在两菌之间的转移。进一步研究发现,无论是宿主细菌还是受体细菌其细胞活性在GO处理下均显著下降。400 mg LGO使供体菌和受体菌活性分别降至对照的0.42倍和0.45倍。显微观察及生理指标分析证实,GO显著诱导了氧化应激反应,促使两类细菌的细胞膜边缘模糊或破损,细胞膜通透性显著上升,细菌之间的黏附和接触增强。上述结果可能是GO促进RP4质粒接合转移频率上升的因素。转录组学分析揭示,供体菌和受体菌中与细胞膜相关的omp A、omp W和bam C等、氧化应激相关的oxy R、gor和ahp C等、调控ATP生成相关基因atp A、atp B和atp E等以及接合转移相关的kor A、kor B和trb B等基因在GO作用下表达水平也发生了变化。相较而言,GO处理下枯草芽孢杆菌可检测到的细胞膜和细胞壁相关的差异性基因相对较少,这可能与其革兰氏阳性菌的细胞壁特性有关。综上,本研究认为GO可促进ARGs在不同类型菌属之间的传播,具有一定的生态风险和潜在危害。（2）为了探明GO对RP4质粒从细菌转移到植物的影响,我们向水稻培养液中接种携带RP4质粒介导的ARGs的枯草芽孢杆菌。结果表明,在0-400 mg LGO的处理下,RP4质粒从水稻培养液中转移到根内部下降了13%～71%,随着转运因子的下降,RP4质粒从地下部到地上部的迁移能力也显著减弱。以上现象可能跟以下几个方面有关:（1）GO浓度越高,水稻营养液p H值越低,并伴随着培养体系内抗生素抗性细菌（ARBs）数量的大幅度减少。（2）GO处理诱导了水稻氧化胁迫,主要表现为伊文思蓝染色的加重和丙二醛的上升。并且,抗氧化酶苯丙氨酸解氨酶和抗逆信号分子一氧化氮也随着GO浓度的增加急剧上升。氧化胁迫导致植物生长不利,水稻根长、株高、鲜重和木质素都随GO浓度的增加而显著抑制,也可能不利于ARGs在植物体内的上运。进一步显微观察发现GO可以进入根细胞,但并未到达叶肉细胞。（3）共培养后,可检测到多个芽孢杆菌可能携带PR4质粒,如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌等。（3）高通量测序表明,GO降低了水稻内生菌群落结构的多样性和丰富度,尤其是芽孢杆菌属的相对丰度,这将不利于ARGs在同种属之间的转移。并且,GO处理后降低了多个有益菌群如芽孢杆菌科和根瘤菌科的相对丰度,这不利于植物生长,改变了内生菌群的生存环境。此外,GO减少了细菌生物膜的形成和移动元件的相对丰度,对内生菌的交流和定殖具有负面影响,不利于ARGs在植物内生菌之间传播。综上,尽管GO不利于RP4质粒在植物培养体系中的转移,但其环境生态风险仍不容忽视。
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