关键词:
运动训练
矽肺
肽基精氨酸脱亚胺酶
瓜氨酸化修饰
巨噬细胞
摘要:
目的研究肽基精氨酸脱亚胺酶2(PADI2)药理性阻断、基因敲除和运动训练通过抑制瓜氨酸化修饰,拮抗矽肺纤维化的作用机制。
方法1模型建立。构建矽肺小鼠模型,分别给予氯膦酸盐脂质体(巨噬细胞清除剂)、PADI2抑制剂AFM30a、运动训练干预,并构建巨噬细胞特异性Padi2敲除小鼠模型;体外研究建立SiO2诱导的RAW264.7细胞模型,给予小干扰RNA(siRNA)-Srb1、si-Padi2、Toll样受体4(TLR4)抑制剂TLR4-C34和AFM30a预处理。2检测方法和指标。全身体积描记检测(WBP)系统检测肺功能;微计算机断层扫描技术(Micro CT)重建肺3D模型;H.E.染色、V.G.染色和弹力蛋白染色观察肺组织病理形态;酶联免疫法(ELISA)检测煤工尘肺患者血清瓜氨酸波形蛋白(Cit-Vim)的表达;瓜氨酸化修饰组学和转录组测序获取矽肺小鼠瓜氨酸化修饰蛋白和差异m RNA表达基因谱;免疫组织化学染色观察实验性矽肺模型肺组织中PADI2的表达;免疫荧光染色观察肺组织和RAW264.7巨噬细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TLR4、白细胞介素17A(IL-17A)、C-X-C基序趋化因子5(CXCL5)、C-X-C基序趋化因子受体2(CXCR2)、瓜氨酸肽(Cit)和波形蛋白(Vim)的表达。免疫印迹法检测:1)PADIs及Cit相关蛋白:PADI2、PADI3、PADI4、Cit、Cit-Vim、早期生长反应因子1(Egr1);2)纤维化指标:Ⅰ型胶原前体(Pro CoL Ⅰ)、纤维连接蛋白1(FN1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA);3)炎症指标:TNF-α、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β);4)TLR4信号:TLR4、髓系分化初级反应蛋白(My D88)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IκBα);5)TGF-β1信号:TGF-β1、TGFβ受体IⅠ型(TGFβRII)、p-Smad2/3;6)清道夫受体信号:B类1型清道夫受体(SR-B1)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3);7)IL-17信号:IL-17A和IL-17R;8)趋化因子信号:CXCL5和CXCR2。
结果1运动训练拮抗矽肺小鼠肺纤维化的作用机制。H.E.染色、弹力蛋白染色、Micro CT和WBP结果显示,与矽肺模型组相比较,运动训练显著减小矽肺小鼠矽结节面积、胶原蛋白沉积面积、稳定弹力蛋白水平和减小纤维化体积,改善肺功能;转录组测序、免疫荧光染色和免疫印迹法结果显示,运动训练显著下调PADI2、Cit、Cit-Vim、TLR4-TNF-α炎症信号、TGF-β1信号、SR-B1-NLRP3信号、IL-17A信号、CXCL5-CXCR2信号的异常激活。2小鼠矽肺纤维化瓜氨酸修饰蛋白表达变化谱。瓜氨酸化修饰组学结果显示,与对照组相比较,矽肺模型组肺组织中共有101个瓜氨酸化修饰蛋白表达上调,43个瓜氨酸化修饰蛋白表达下调;GO分析结果显示,表达上调的瓜氨酸化修饰蛋白主要与氧化应激等相关,表达下调的瓜氨酸化修饰蛋白主要与组织发育等相关;KEGG结果显示,表达上调的瓜氨酸化修饰蛋白主要参与自身免疫性疾病的发生发展,表达下调的瓜氨酸化修饰蛋白主要参与心肌病的发生发展;蛋白质互作网络图结果显示,Vim被显著富集。ELISA结果显示,与对照组相比较,尘肺患者血清中Cit-Vim含量增加;免疫化学染色、免疫荧光染色和免疫印迹法结果显示,与对照组相比较,矽肺大鼠、矽肺小鼠和SiO2诱导的RAW264.7细胞中PADI2、Cit和Cit-Vim表达上调;矽肺小鼠经氯膦酸盐脂质体处理后,PADI2、Cit和Cit-Vim表达下调;SiO2诱导的RAW264.7细胞通过沉默SR-B1或抑制TLR4后,发现PADI2、Cit和Cit-Vim的表达下调。3 PADI2抑制剂AFM30a拮抗矽肺小鼠肺纤维化的作用机制。H.E.染色、V.G.染色、Micro CT和WBP结果显示,与矽肺模型组相比较,AFM30a显著减小矽肺小鼠矽结节面积、胶原蛋白沉积面积和纤维化体积,改善肺功能;免疫荧光染色和免疫印迹法结果显示,AFM30a显著下调矽肺小鼠肺组织和SiO2诱导的RAW264.7细胞中Pro CoL Ⅰ、FN1、PADI2、Cit、Cit-Vim、TGF-β1、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。4靶向巨噬细胞敲除Padi2抑制矽肺小鼠肺纤维化的作用机制。H.E.染色、V.G.染色、Micro CT和WBP结果显示,与野生矽肺模型组相比较,靶向巨噬细胞敲除Padi2显著减小矽肺小鼠矽结节面积、胶原蛋白沉积面积和纤维化体积,改善肺功能;转录组测序、免疫荧光染色和免疫