关键词:
皮质脊髓运动神经元
化学遗传学激活神经元
运动训练
功能恢复
脊髓损伤
联合疗法
摘要:
背景:
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重致残性疾病,主要临床表现为损伤平面以下出现永久性肌肉瘫痪、躯体感觉障碍及自主神经功能损害。高昂的医疗费用加剧患者的心理健康问题,同时也给家庭和社会带来沉重的负担。如何促进SCI患者神经修复及功能恢复仍是一个待解决的医学难题。
目的:
探究慢性化学遗传学激活皮质脊髓运动神经元(corticospinal motoneurons,CMNs)的单一疗法,和结合多形式运动训练(跑步机运动和单粒抓取任务)的联合疗法能否促进成年小鼠颈髓损伤后的运动功能恢复及其可能机制。
方法:
1.为了探究化学遗传学激活单侧前肢皮层功能区的谷氨酸能神经元对未损伤小鼠运动行为的影响,在小鼠左侧前肢皮层功能区注射病毒AAV-Ca MKⅡα-h M3Dq-EGFP。病毒表达3周后,通过注射氯氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)激活谷氨酸能神经元,进行运动行为学测试;
2.为了探究化学遗传学激活单侧前肢皮层功能区CMNs的单一疗法对SCI小鼠轴突再生及运动功能恢复的影响,在小鼠左侧前肢皮层功能区注射病毒AAV-h Syn-DIO-h M3Dq-m Cherry,颈髓第5段双侧注射AAV-Retro-h Syn-Cre-EGFP,使左侧前肢皮层功能区的CMNs选择性表达h M3Dq。病毒表达3周后,通过注射CNO实现化学遗传学选择性激活CMNs,检测小鼠运动行为学。随后小鼠进行颈髓C5段背侧半切(cervical 5 dorsal hemisection,C5DH)损伤造模手术。术后第1周开始,小鼠每两天注射一次CNO或等体积的生理盐水,3次/周,持续5周。造模术后6周,采用一系列行为学测试评估损伤小鼠的运动功能,左侧前肢皮层功能区注射生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)示踪CST轴突的再生情况;
3.为了探究化学遗传学激活皮层神经元对神经突起生长的影响,采用病毒AAV-h Syn-h M3Dq-m Cherry转染培养的新生小鼠皮层神经元以表达h M3Dq,CNO作用5天后进行免疫细胞化学分析神经突起生长的变化并探究分子机制;
4.为了探究化学遗传学激活单侧前肢皮层功能区CMNs结合多形式运动训练的联合疗法对SCI小鼠运动功能恢复的影响,在小鼠左侧前肢皮层功能区注射病毒AAV-h Syn-DIO-h M3Dq-m Cherry,颈髓C5段双侧注射AAV-Retro-h Syn-Cre-EGFP,使左侧前肢皮层功能区的CMNs选择性表达h M3Dq。病毒表达3周后,小鼠建立C5DH损伤模型。损伤小鼠分为4组:(1)生理盐水对照组(Saline);(2)慢性CNO激活组(CNO);(3)运动训练组(Training);(4)慢性CNO激活联合运动训练组(CNO+Training)。造模术后第1周开始,CNO和CNO+Training组小鼠每两天注射一次CNO,3次/周,持续5周,Saline和Training组小鼠注射等体积的生理盐水。造模术后第4周到第6周,Training和CNO+Training组小鼠进行跑步机运动和单粒抓取任务的运动训练。造模术后6周,采用一系列行为学测试评估损伤小鼠运动功能恢复,电生理学记录肱二头肌肌纤维的肌电信号,小鼠脑或脊髓切片进行组织学染色分析。
结果:
1.化学遗传学激活左侧前肢皮层功能区的谷氨酸能神经元引起小鼠运动亢奋,出现右前肢抖动、前爪频繁离地及围绕鼠笼边缘转圈式行走的异常行为表现;
2.化学遗传学选择性激活左侧前肢皮层功能区CMNs增加其c-Fos表达和核糖体蛋白S6磷酸化水平,未引起小鼠明显行为异常。C5DH造模术后6周,慢性化学遗传学激活左侧前肢皮层功能区CMNs的单一疗法未显著促进颈髓损伤小鼠运动功能恢复,促进CST轴突有限再生;
3.化学遗传学激活培养的皮层神经元促进最长神经突起延长,减少神经突起分支数,下调神经突起远端微管蛋白乙酰化水平,与激活其m TOR信号通路相关;
4.慢性化学遗传学激活左侧前肢皮层功能区CMNs结合多形式运动训练的联合疗法促进颈髓损伤小鼠运动功能和前肢精细运动协调功能恢复,肌电图记录和组织学分析显示,联合疗法增强皮层到支配肌肉的功能连接,增加脊髓环路中被兴奋的肌纤维数,增加颈髓灰质中Ⅰ型囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 1,v Glut1)阳性纤维密度,增加颈髓灰质第Ⅸ板层中乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)阳性运动神经元数量,激活其m TOR信号通路并减少Ch AT阳性运动神经元凋亡。
结论:
慢性化学遗传学激活单侧前肢皮层功能