关键词:
小鼠
肿瘤
运动
缺氧
HIF-1α
摘要:
目的:恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康,我国的恶性肿瘤的发病率和死亡率都逐年上升。近年来,有一些科研工作者认为现阶段的研究重点不在于怎么杀死肿瘤细胞,而是在于如何有效的控制肿瘤细胞的发生发展,使其不在机体内随意扩散而演变成癌症。实体肿瘤有着缺氧微环境的关键特征。运动可以有效改善细胞有氧氧化的能力,缺氧诱导因子可能在肿瘤细胞的发展和转移过程中发挥着极其关键的作用。运动对于缺氧诱导因子的改善,已有很多文献报道过。本实验以建立早期运动训练干预小鼠肝脏肿瘤模型和不同氧含量环境培养的小鼠肝脏肿瘤细胞模型,探究预运动对小鼠肝脏肿瘤中HIF-1α/BNIP3通路的影响,以及不同氧含量微环境下小鼠肝脏肿瘤细胞中的HIF-1α-BNIP3通路的变化情况,为小鼠肝脏肿瘤的控制提供新的思路。方法:1、选取C57BL/6J雄性小鼠24只,随机分为2组,分别为:对照组(C)、运动组(E)。运动组经过中等强度跑台训练12周(速度为12m/min),C组正常饲养12周后,再分别将两组分开进行小鼠肿瘤模型的构建并分为4组,分别为:安静对照组(C)、运动组(E)、安静肿瘤组(CT)、运动肿瘤组(ET)。Hepa1-6细胞(小鼠肝癌细胞系)用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃、5%的CO培养箱中培养。当Hepa1-6细胞生长至对数生长期时可以用于实验注射。用水合氯醛麻醉小鼠,常规消毒手术环境及手术器械,取仰卧位将小鼠固定于鼠板,沿着小鼠左侧肋骨下缘,从左至右剪开约2cm左右的切口,使肝脏最左边的肝小叶暴露于切口视野内,取1ml注射器吸取100μl的Hepa1-6细胞悬液(含2×10cell)。刺入肝脏约0.5cm后,缓慢匀速的将细胞悬液注入肝脏,注射完成后至无液体和血液渗出时小心拔出针头,进行注射时注意不要使锋利的针头划破肝脏,拔出注射器后立即用止血纱布轻压止血,逐层关腹消毒。术后继续清洁饲养,自由饮食。待小鼠成功成瘤后取材进行随后实验。2、构建小鼠肝脏肿瘤细胞培养模型:采用Hepa1-6肝癌细胞,小鼠腹腔接种,接种方法同上述小鼠肝肿瘤模型的建立方法,自由饮食生存14d后,将小鼠断颈处死后提取带瘤肝组织,用PBS清洗后适当剪碎,用10ml注射器针芯在200目筛网上轻轻研压组织,挤压完成后用培养基冲洗细胞筛网获得肿瘤细胞悬液。肿瘤细胞悬液用培养基调整为1×10/mL浓度,置于37C、5%CO培养箱中培养细胞,取对数生长期的肿瘤细胞,以每孔7×10个接种于24孔板上分别于低氧(7%O、5%CO、88%N)(D)、乏氧(14%O、5%CO、81%N)(F)、常氧(21%O、5%CO、74%N)(O)培养箱中培养,24小时后收集细胞进行进一步实验。3、MTT比色法、Western Blotting蛋白印迹法、细胞免疫荧光检测小鼠肝脏肿瘤组织和小鼠肿瘤细胞中的自噬相关蛋白、凋亡相关蛋白、缺氧诱导因子相关蛋白和肿瘤细胞生长等等的变化情况。利用Quantity One软件进行蛋白灰度值分析,利用GraphPad Prism 5.0软件进行图表的制作,运用SPSS 22.0软件进行统计学分析,用均数±标准差表示统计结果,单因素(One-way ANOVA)用于比较实验组和对照组之间的差异,双因素方差分析(Two-way ANOVA)比较组间差异,p<0.05判为具有显著差异性。结果:1、与C组相比,CT组肝肿瘤HIF-1α明显升高(p<0.01)。与E组相比,ET组肝肿瘤HIF-1α明显升高(p<0.05)。与CT组相比,ET组肝肿瘤HIF-1α明显降低(p<0.01)。与C组相比,E组肝肿瘤BNIP3明显降低(p<0.01)。CT组肝肿瘤BNIP3明显降低(p<0.01)。与CT组相比,ET组肝肿瘤BNIP3明显降低(p<0.01)。2、与C组相比,E组和CT组肝脏肿瘤中BCL-2的表达水平显着增加。(p<0.05,p<0.01)。与CT组相比,ET组肝脏肿瘤组织中BCL-2的表达水平明显升高(p<0.05)。与E组相比,ET组肝脏肿瘤组织中BCL-2的表达水平均显着升高(p<0.01)。与C组相比,E组和CT组肝脏肿瘤中BAX的表达水平显着增加(p<0.01)。与CT组相比,ET组肝脏肿瘤中BAX明显升高(p<0.05)。与E组相比,ET组肝脏肿瘤中BAX的表达水平显着升高(p<0.01)。与C组相比,E组BCL-2与BAX的比值显着升高(p<0.05),CT组比值明显降低(p<0.01)。与CT组相比,ET组比值显着降低(p<0.01);与E组相比,ET组比值显着下降(p<0.01)。3、与C组相比,E组和CT组小鼠肝脏肿瘤中LC3II/LC3I的比值显着升高(p<0.01)。与CT组相比,ET组LC3II/LC3I比值明显升高(p<0.05);与E组相比,ET