关键词:
帕金森病
运动训练
关键脑区
炎症
肠道菌
摘要:
帕金森病(PD)是一种以黑质多巴胺能神经元进行性丢失和路易小体形成为主要病理变化的神经系统退行性疾病。多项临床试验和动物实验表明运动训练可有效改善PD患者的运动平衡障碍,其分子机制可能涉及运动促进多巴胺分泌、保护线粒体功能、改善炎症等。但不同脑区在PD发生发展中的受累程度不一,且运动对各个脑区产生的影响存在不同。目前尚不清楚运动训练对运动调控相关脑区的作用差异,亦不清楚机体的脑外差异对脑内相关脑区的影响机制。为此,需要更加系统、全面地评估PD训练前后运动皮层、纹状体、黑质及小脑多个相关脑区基因表达的差异及可能的中枢以外的调控作用,进而阐明PD中运动训练纠正平衡障碍的分子机制。第一部分运动训练改善PD小鼠脑内病理和行为学的作用研究目的探讨运动训练在改善PD模型小鼠脑内病理和运动症状中的作用。方法1、分组:8-10周龄C57BL/6J雌性小鼠分为三组:Saline组,MPTP组及MPTP+EX组。Saline组:生理盐水(5ml/kg)皮下注射,丙磺舒(250mg/kg)腹腔注射;MPTP组:MPTP(25mg/kg)皮下注射,丙磺舒(250mg/kg)腹腔注射,每周2次连续10次;MPTP+EX组:MPTP(25mg/kg)皮下注射,丙磺舒(250mg/kg)腹腔注射,每周2次连续10次,造模完成后进行运动训练。2、行为学评估:对造模完成及运动训练完成后的小鼠进行行为学评估(转棒、爬杆、旷场)并记录。3、运动训练方案:训练使用5带电动啮齿动物跑步机进行(Columbus Instruments,Columbus,OH,USA)。MPTP+EX组小鼠在PD造模完成5天后开始训练,持续12周,每周训练5天,每次40分钟。跑步机速度为6米/分5分钟,9米/分5分钟,12米/分20分钟,15米/分5分钟,12米/分5分钟。在MPTP+EX组训练时,MPTP组及Saline组小鼠放置于同样房间,但不进行运动训练。4、实验室检查:运动训练结束后,完成各组小鼠脑组织取材。并对各组小鼠黑质区组织进行酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫荧光染色(immunofluorescent staining)及蛋白免疫印迹(Westernblot)实验。通过黑质区TH表达的变化,验证PD模型是否成功并探究运动干预对黑质区DA能神经元的影响。结果1、行为学实验结果显示:MPTP组小鼠在转棒、爬杆及旷场三个指标上运动能力显著下降,运动训练后(MPTP+EX组)显著改善。2、TH免疫荧光染色及Westernblot结果显示:与Saline组相比,TH阳性的多巴胺(DA)能神经元在MPTP组及MPTP+EX组小鼠均显著减少了70%,提示运动训练不能挽回PD小鼠黑质区丢失的DA能神经元数量。结论PD小鼠黑质区DA能神经元数量减少,运动行为受损。运动能够改善PD小鼠受损的行为学,但不增加PD小鼠黑质区DA神经元的数量。第二部分运动训练改善PD小鼠相关脑区基因表达的差异研究目的探讨运动训练前后PD小鼠相关脑区(皮层、小脑、黑质及纹状体)基因表达水平的变化;寻找响应运动最重要的脑区并阐明训练改善PD小鼠运动症状的分子机制。方法1、训练完成5天后,Saline组、MPTP组、MPTP+EX组每组随机分配4只小鼠。麻醉后用PBS心脏灌注,尽快取出整脑。并及时在冰盘上取下小脑,解剖显微镜下分离出纹状体、黑质、大脑运动皮质,并提取总RNA。2、基因表达谱检测:每个样本抽取其中500 ng总RNA作为实验材料,使用Ion Total RNA-Seq Kit v2进行c DNA文库构建。使用Qubit Fluorometer(Invitrogen,USA)检测文库质量和浓度。然后从每个样本c DNA文库中各取稀释后的10 p M样品通过Ion ProtonSystem系统进行测序。3、基因表达谱分析:应用生物信息学分析软件对数据进行基因覆盖率和测序深度分析、基因表达差异分析(聚类分析、GO分析、Pathway分析)、转录因子分析、RHHO分析,筛选关键调控部位及分子调控机制。4、每组5只小鼠麻醉后,PBS心脏灌注,取出脑组织,固定包埋切片,通过免疫荧光实验进一步验证其潜在调控机制。结果PD小鼠运动训练后对其皮层、小脑、黑质及纹状体区进行分析,发现:1、对4个相关脑区的PD造模及运动训练后差异基因分析发现,黑质-纹状体系统是响应PD及PD运动训练后差异基因数量变化及幅度变化最显著的部位,提示它很可能是PD运动训练后调控运动症状改善的关键部位。2、对4个脑区分别进行分析,皮层部位上调通路包括:磷酸肌醇3激酶信号的调节,血管相关平滑肌细胞迁移的调节,细胞运动的正向调节,上皮细胞增殖,内皮细胞发育等代谢、血管生成等相关的通路;其下调通路包括及昼夜节律相关通路。小