关键词：
DRG神经元
凹陷小窝
网格蛋白小窝
Piezo2通道
STORM
摘要：
Piezo机械门控离子通道（Piezo mechano-gated ion channel）是在2010年由Coste等发现并克隆。该通道家族含有Piezo1和Piezo2两个成员,它们在包括膀胱、结肠和肺等多种组织中表达,Piezo2在背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）表达丰富。Piezo通道可被机械力直接激活,产生快激活、失活动力学多变的机械及门控电流。其中Piezo2机械门控电流具有快激活、快失活特征（Rapidly adapting,RA,失活时间常数τ<10 ms）。Piezo通道是唯一公认的哺乳动物机械门控离子通道,近年来,其结构、生物物理特性、功能调节等的研究及其生理学和病理生理学意义得到越来越多的揭示。条件性敲除小鼠DRG感觉神经元Piezo2通道使其低阈值触觉显著受损。Piezo2功能缺失性突变可导致人的无毛皮肤低阈值触觉丧失、两点触摸分辨能力下降等。抑制或敲除DRG神经元Piezo2通道可消除炎性痛或神经病理性疼痛动物的机械性痛觉异常（Mechanical allodynia,MA）。因此,Piezo2生理状态下介导哺乳动物的低阈值触觉（Low-threshold touch sensation）,病理情况下介导由低阈值触觉诱发的MA。然而,目前虽已确认Piezo2是介导MA的分子基础,但其确切分子机制仍属未知。我们的前期研究证实,细胞内高渗液（Hyper-osmolarity）或细胞外低渗液（Hypo-osmolarity）促使细胞膨胀,可显著增大DRG神经元细胞膜张力,同时显著增大其Piezo2/RA电流,动物脚掌注射低渗液可诱发MA。细胞膜张力变化是Piezo2通道功能调节的重要分子基础。利用不稳定波动分析可知,在DRG神经元细胞膜张力显著增大时,Piezo2单通道电流虽有增大趋势却无显著性差异,而细胞膜上Piezo2通道的数目却增大约4倍。我们利用Western blot技术检测低渗液孵育DRG神经元后Piezo2的总表达量,无显著变化。因此,我们推测,在未见DRG感觉神经元Piezo2通道总表达量显著上调的情况下,其细胞膜张力显著增大,促使膜上Piezo2通道的数量显著上调,可能介导了炎症或神经病理性损伤时MA的产生。这显然是动员了某种储备形式的Piezo2,使之膜转位增加所致。那么Piezo2储备在哪儿呢?凹陷小窝（Caveolae）是典型的细胞膜内陷结构,呈烧瓶状或开口杯状,“瓶身”宽60-80 nm,长不超过100 nm,也被人认为是脂筏（Lipid rafts）的主要结构,富含胆固醇和鞘磷脂成分。网格蛋白小窝（Clathrin-coated pits,CCP）类似,宽60-120 nm,长不超过150 nm,因网格蛋白（Clathrin,Cla）包裹而得名,富含磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI（4,5）P2)。一方面二者是许多信号分子、营养物质等内化（内吞）进入细胞的重要机制和途径,小窝蛋白（Caveolin,含Caveolin-1、-2和-3三个亚型）和网格蛋白分别是二者内化的装配启动分子。另一方面二者是细胞膜的“备胎”,即正常时作为细胞膜的储备（Membrane reservoir）,必要时可补充细胞膜。在细胞膜张力急剧增大时,二者可中止内化、外翻上膜并被拉平（flattening）以补充细胞膜,缓冲细胞膜张力增大,保持细胞膜完整而不被撕裂;信号分子等也随之上膜。综上所述,我们猜想Piezo2可能隐藏于DRG神经元的细胞膜内陷结构如凹陷小窝或网格蛋白小窝中。正常情况下,细胞膜Piezo2通道接受机械刺激介导低阈值触觉,内陷结构中的Piezo2通道因不能接受有效机械刺激不能表现功能;当细胞膨胀、炎症或神经损伤时,DRG神经元细胞膜张力显著增大,促使凹陷小窝或者网格蛋白小窝结构中的Piezo2通道外翻上膜,使细胞膜Piezo2通道数目显著增加,接受有效机械刺激显著增强Piezo2/RA电流而介导MA。本课题将分为两部分对DRG神经元Piezo2机械门控通道的膜动力学及其在疼痛中的作用进行研究。第一部分DRG神经元Piezo2通道膜动力学研究目的:研究Piezo2通道在凹陷小窝和/或网格蛋白小窝的分布;研究在促进内化或上膜的因素的作用下,Piezo2随小窝内化或上膜的膜动力学过程及调控机制。方法:（1）以Caveolin-1和Clathrin分别为凹陷小窝和网格蛋白小窝标志物,利用激光扫描共聚焦显微镜技术（LSCM）和全内反射激光共聚焦显微镜技术（TIRFM）、超高分辨率显微镜技术（STORM）和荧光共振能量转移技术（FRET）等研究Piezo2和Caveolin-1或Clathrin的细胞共定位关系及相互作用。（2）利用LSCM、TIRF、STORM和免疫蛋白印迹
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