关键词:
神经病学
腺相关病毒
TFEB基因
重组质粒
基因过表达
炎症反应
摘要:
本文分为以下两个部分进行探讨: 第一部分 TFEB基因重组8型腺相关病毒载体的构建及鉴定 背景: 溶酶体的功能障碍与多种疾病有关,例如:溶酶体贮积症(lysosomal storage diseases,LSDs)、脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy,CAA)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)、帕金森病(Parkinson's disease,PD)、亨延顿病(Huntington disease,HD)等神经变性疾病.TFEB基因是溶酶体的主控基因,已有实验研究报道TFEB的过表达能够从发病机制上治疗AD[1,2]、PD[3]、HD[4]、部分LSDs[5].因此,它的发现为这类疾病的治疗带来了新思路. TFEB基因治疗的前提是构建合适的基因载体,基因载体有病毒载体和非病毒载体,非病毒载体包括质粒、"脂质体"等,它们虽然安全、大部分不引起免疫反应和携带大分子的基因,但是导入外源性基因效率低下、不能长时间表达目的基因[6];病毒载体目前有猿猴病毒40(SV40)[7]、逆转录病毒[8]、腺病毒[9]、疱疹病毒[10]等,但是这些病毒作为基因治疗载体均有不同程度缺陷,例如SV40病毒仅能表达有限的一段时间,随着细胞的分裂不断被稀释减弱.19世纪80年代腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)首次作为基因载体使用[11],发现其能有效和安全的感染细胞.随着新的技术在包装病毒衣壳工程和提高AAV载体基因包装能力的应用,使AAV载体作为基因载体有更广泛的使用.重组腺相关病毒(rAAV)不仅具有转染率高和感染细胞范围广泛,还能克服以往病毒载体表达时间短的缺点,它能够持续长时间表达而不减退[12],这也意味着在基因治疗时仅需使用rAAV载体一次可以持续终身.AAV有以上诸多优点,所以本实验选择AAV作为TFEB基因的载体,目前国内暂无关于TFEB基因的AAV载体构建的研究报道. 目的: 构建并包装小鼠TFEB基因的重组8型腺相关病毒(rAAV8)载体和带有ZsGREEN的rAAV8空载体,通过感染HEK293细胞来观察外源性TFEB基因在细胞水平表达情况. 方法: 1.将带有目的基因的质粒pUC57-mTFEB和载体质粒分别进行酶切、连接、转化,得到重组质粒pAAV-CMV-mTFEB,并进行PCR测序和鉴定;2.将鉴定正确带有mTFEB基因的重组质粒和pAAV-CMV-ZsGREEN质粒,进行AAV8病毒包装,通过PCR测病毒滴度. 3.正确包装带有目的基因的重组腺相关病毒载体后,感染HEK293细胞,通过Western Blotting观察TFEB基因在HEK293细胞表达情况. 结果: 1.酶切鉴定、测序和琼脂糖凝胶电泳证明了TFEB的rAAV病毒载体成功构建;***2/8-CMV-mTFEB和rAAV2/8-CMV-ZsGREEN病毒滴度分别为4.65×1012vg/ml、9.79×1012vg/ml 3.细胞实验表明,相比对照组(空载体组),实验组的TFEB基因表达水平升高6倍余(p<0.01,n=3/组). 结论: ***2/8-CMV-mTFEB和rAAV2/8-CMV-ZsGREEN载体构建和包装成功;2.带有mTFEB的重组腺相关病毒载体能够有效的感染HEK293细胞,并且TFEB基因能够在细胞水平过表达. 第二部分 TFEB基因在C57BL/6小鼠Barrel脑区的过表达及其与脑皮质炎症反应关系的初步探索 背景: 在本论文的第一部分实验已经成功构建TFEB基因的rAAV8病毒载体,并在细胞水平证明了外源性TFEB基因能够表达;但是,在活体内外源性基因的表达由于受到免疫系统的影响,可能出现表达减弱、缺失等;另一方面可能存在这种情况:外源性基因过表达,但是没有生物活性,不能调控下游基因的表达,因此有必要进一步研究TFEB基因通过rAAV8载体在活体的表达情况,本部分实验以C57/6小鼠为研究对象,注射TFEB基因载体,观察TFEB基因表达情况和对下游基因的调控能力. 使用病毒载体进行基因治疗时不可避免要考虑伦理、安全问题、毒理或药物副作用.TFEB基因与很多细胞信号通路有关,有研究报道Toll样受体(Toll like receptor,TLR)是TFEB基因的直接目标基因[13],TLR能通过经典的TLR-NF-κB信号通路诱导炎症反应[14],因此,我们提出假设:当TFEB基因过表达时是否同样诱发严重的炎症反应?外源性病毒载体或基因产物,尤其是机体初次接触时,同样可能诱发炎症或免疫反应,导致外源性基因表达水平下降、持续时间缩短等.rAAV8介导的TFEB基因过表达是否诱发严重的炎症反