关键词： Adenovirus   bat   diagnostic assays   Malsoor virus   polymerase chain reaction   Rousettus  

摘要： Background & objectives: Bats are recognized as important reservoirs for emerging infectious disease and some unknown viral diseases. Two novel viruses, Malsoor virus (family Bunyaviridae, genus, Phlebovirus) and a novel adenovirus (AdV) (family, Adenoviridae genus, Mastadenovirus), were identified from Rousettus bats in the Maharashtra State of India. This study was done to develop and optimize real time reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) assays for Malsoor virus and real time and nested PCR for adenovirus from Rousettus bats. Methods: For rapid and accurate screening of Malsoor virus and adenovirus a nested polymerase chain reaction and TaqMan-based real-time PCR were developed. Highly conserved region of nucleoprotein gene of phleboviruses and polymerase gene sequence from the Indian bat AdV isolate polyprotein gene were selected respectively for diagnostic assay development of Malsoor virus and AdV. Sensitivity and specificity of assays were calculated and optimized assays were used to screen bat samples. Results: Molecular diagnostic assays were developed for screening of Malsoor virus and AdV and those were found to be specific. Based on the experiments performed with different parameters, nested PCR was found to be more sensitive than real-time PCR;however, for rapid screening, real-time PCR can be used and further nested PCR can be used for final confirmation or in those laboratories where real-time facility/expertise is not existing. Interpretation & conclusions: This study reports the development and optimization of nested RT-PCR and a TaqMan-based real-time PCR for Malsoor virus and AdV. The diagnostic assays can be used for rapid detection of these novel viruses to understand their prevalence among bat population.

关键词： 蝙蝠   病原   宏基因组   流行病学  

摘要： 蝙蝠是数量仅次于啮齿类动物的翼手目(Chiroptera)类哺乳动物,共包含19个科962种,在全球范围内广泛分布。蝙蝠携带病原种类繁多,其中检测到病毒137种,涉及人畜共患病病毒61种。值得注意的是这其中包括一些对人高致病性的病毒,如SARS样冠状病毒(SARS-like coronavirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、狂犬病毒(Rabies virus)、登革病毒(Dengue virus)等。近期研究结果表明一些新病毒正陆续从蝙蝠体内被发现,包括肝炎病毒(Hepatitis virus)、呼肠孤病毒(Retrovirus)、博卡病毒(Bocavirus)、圆环病毒(Circovirus)、星状病毒(Astrovirus)等均发现一些新的种。2003年的“非典”疫情,共造成全球8,000多人感染,至少800人死亡,使冠状病毒在全球范围内引起关注。2014年西非的埃博拉疫情,导致6,388人丧生,确诊或疑似感染病例17,942个。2016年阿根廷的登革病毒疫情,造成15,000人感染。引发这几次疫情的病原有一个共同的动物宿主——蝙蝠。因此,蝙蝠作为自然界贮存病原的巨大病原库,引起了越来越多科研工作者的关注。病毒宏基因组学是在宏基因组学理论基础上,结合传统病原检测技术新兴的学科分支,其应用迅速展示出巨大的优越性,尤其是在新发病毒的发现和预警方面,突破了传统方法依赖病毒保守基因序列的局限性。本研究基于病毒宏基因组学策略,系统分析2015年7-8月从我国东南沿海部分地区共收集的5种210只蝙蝠。对采集的蝙蝠的肠和肺组织进行高通量测序,对测序结果进行分类整理,发现获得的序列信息共涉及38个病毒科。其中包括16个脊椎动物病毒科、4个植物病毒科、5个昆虫病毒科。感染脊椎动物的病毒包括冠状病毒科(Coronaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、双小RNA病毒科(Picornaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、非洲猪瘟样病毒病毒科(Asfarviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae);圆环病毒科(Circoviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、呼肠孤病毒科(Retroviridae);黄病毒科(Flaviviridae)、痘病毒科(Poxviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。通过序列分析比较发现,不同地区和不同蝙蝠种类在注释到的病毒种类、序列方面存在同源性和丰度差异。初步掌握了东南沿海部分地区蝙蝠携带病毒的生态学状况,为下一步验证工作的开展提供了方向。根据宏基因组注释信息,选取了圆环病毒、博卡病毒、软腐病毒等设计简并引物,应用特异性RT-PCR检测方法,获取了上述病毒在蝙蝠体内和不同地域的携带和分布情况。结果显示在舟山、岱山、长乐、连江蝙蝠体内各检测到1株圆环病毒,分别命名为Bt CV-ZS62、Bt CV-DS13、BtCV-CL6、BtCV-LJ22;在岱山蝙蝠体内检测到2株博卡病毒,命名为:Bt Bov-DS9和Bt Bov-DS10;在厦门蝙蝠体内检测到2株软腐病毒,命名为BtIFA-XM9和BtIFA-XM10。基于宏基因测序注释信息,借助已知同源序列保守区设计系列简并套式引物,经反向PCR扩增、序列测定和拼接,进一步获得了其中4株圆环病毒的全基因序列(1,873bp、1,910bp、2,051bp、1,806bp)和1株博卡病毒的大部分序列(3,921bp)。依据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)关于圆环病毒新种的判定标准,初步判断BtCV-ZS62、BtCV-DS13、Bt CV-CL6、BtCV-LJ22是四种新的蝙蝠圆环病毒,属于圆环病毒科,圆环病毒属。根据ICTV关于博卡细小病毒新种的判定标准,初步判断Bt Bov-DS10是一株全新的博卡细小病毒。在获得上述病毒基因组信息基础上,选取圆环病毒、博卡病毒进行重组结构蛋白制备和血清流行病学初步分析,选择结构蛋白Bt BOV-DS10-NP和Bt CV-DS13-Cap进行原核表达和纯化,探索从血清学水平初步验证蝙蝠携带病毒情况,以期完善病毒感染的流行病学证据链。我国蝙蝠种类丰富,有7科130种,分布广泛,其生态圈与人类活动圈有较大交叉。因此开展我国蝙蝠携带病毒的自然本底调查对于预防新发传染病具有重要的公共卫生学意义。本研究借助病毒宏基因组生态调查方法,获得东南沿海

关键词： 呼肠孤病毒   分离鉴定   分子进化   蝙蝠来源   亲缘关系  

摘要： 蝙蝠在人兽共患病（Zoonosis）的传播和流行中起重要的作用。随着人类活动范围不断扩大，蝙蝠的生存地遭到破坏。这就增加了人和蝙蝠的接触机会，促使高致病性的病毒由蝙蝠传播给人类。1994年澳大利亚爆发的亨德拉病毒（Hendra virus, HEV），1997年澳大利亚爆发的梅南高病毒（Menangle virus, MENV）,1998年马来西亚爆发的尼帕病毒（Nipah virus,NIV）以及2002年和2012年分别暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）都对人的生命财产造成巨大损失。而这些新发现的病毒都与人兽共患病的自然宿主蝙蝠密切相关。　　本实验室从我国各地采集了大量蝙蝠样本进行新病原的研究。本研究设计通用引物通过 RT-RCR方法，对2014年采自中国云南省西双版纳州棕果蝠（Rousettus leschenaulti）肛拭子样本进行病毒检测。我们对两批共计450份蝙蝠肛拭子样本进行病毒的分离鉴定工作，从第一批蝙蝠肛拭子样本中分离出5株呼肠孤病毒，第二批肛拭子样本中分离出1株呼肠孤病毒。我们以第二批分离到的呼肠孤病毒为本课题的研究对象。该株病毒暂时命名为Ro-Bat GCCDC2123(Rousettus bat GCCDC2123)。　　将 PCR初筛阳性样本上清接种到 Vero细胞上盲传1代时即可以引起 Vero细胞产生细胞病变，引起细胞膜融合。通过透射电镜发现该病毒粒子为球形，无囊膜，有双层衣壳，病毒粒子直径约70nm。病毒粒子核心电子密度高，不透明，衣壳部分电子密度稍低。在负染和细胞超薄切片中都可以看到完整的病毒粒子和空心未组装完成的病毒粒子同时存在。在Vero细胞超薄切片中还可以观察到病毒包涵体成典型的晶格样排列，符合呼肠孤病毒典型形态。为了对病毒进一步鉴定，我们提取了病毒核酸，进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳图谱结果显示病毒的基因组为多个节段。分为大、中、小3个群，其中L群3个节段、M群3个节段、S群4个节段。该病毒的电泳结果图与Melaka viurs和Xi river reovirus电泳带型相似，具有典型正呼肠孤病毒科病毒成员的特性。　　为了了解该病毒分离株的增殖特性，将病毒感染Vero细胞系，利用荧光定量PCR对病毒滴度进行定量测定。实验结果表明:Ro-BatGCCDC2123分离株可以在Vero细胞系中增殖，引起细胞膜融合产生细胞病变。该株病毒在感染细胞后0-12h滴度维持在一个较低的稳定水平。12h后病毒开始大量复制，滴度逐渐增高，36h后达滴度峰值。　　我们设计特异性引物，经RT-PCR以及RACE实验获得病毒全基因组。序列拼接后显示病毒基因组全长为23407bp，病毒基因组含有10个节段，各片段碱基数为L13896bp，L23832bp，L33954bp,M12295bp,M22145bp,M31984bp,S11603bp,S21322bp,S31192bp,S41184bp。S1片段为多顺反子，含有3个编码阅读框，其他各节段只含有一个编码阅读框架。　　为了明确该病毒分离株与其他纳尔逊海湾呼肠孤病毒成员之间的关系，我们从 Genbank下载了代表株的核酸序列并进行同源性比对分析。结果表明 Ro-Bat GCCDC2123株L2、M3、S2、S3与蝙蝠来源的Cangyuan分离株有较高的相似性，相似度为98.5％，98.9%，96.0%，97.9%;L3、M2、S1与人来源的分离株Melaka有较高的相似度，分别为96.7%，95.9%，94.3%;Ro-BatGCCDC2123株M1、S4与人来源的分离株Kampar相似度较高，为96.8%，91.6%;L1与蝙蝠来源的Pulau相似度较高为93.4%。在M2，S1片段上，Ro-BatGCCDC2123株与Cangyuan分离株仅为78.6%和79.4%。　　为了确定Ro-Bat GCCDC2分离株在呼肠孤病毒中的进化关系，我们以核酸序列全长为基础利用MAGE6软件绘制了进化树。通过进化树图，可以看到哺乳类呼肠孤病毒(MRV)、禽呼肠孤病毒（ARV）、纳尔逊海湾呼肠孤病毒（NBV）为3个不同的进化群。Ro-Bat GCCDC2分离株属于NBV正呼肠孤病毒亚群。而Ro-Bat GCCDC2123分离株在不同的基因节段上表现出不同的亲缘关系。该分离株在L1、L2、M3、S2、S3与蝙蝠来源的Cangyuan分离株亲缘关系最为接近;在L3、M1、M2、S1上与人源的Melaka亲缘关系最为接近。这就提示我们:Ro-Bat GCCDC2分离株是不同分离株之间基因重配的结果。

关键词： 新发传染病   果蝠冠状病毒GCCDC1   异源跨科重组   融合相关小跨膜蛋白（FAST）   亚基因组mRNA  

摘要： 传染病的暴发（outbreak）和流行（pandemic）严重威胁着人类的健康和生存。在全球化（globalization）和工业化（industralization）背景下,疾病的传播和流行异常迅速。而新病原出现的速度也似乎超过了过去的任何时期。野生动物在人兽共患病（zoonosis）的发生、传播和流行中发挥重要作用。对野生动物所携带病原进行检测、分离与鉴定以及论证其与疾病的相关性,成为当前传染病研究的一个新的热点。随着技术的发展,现代分子生物学方法在病原的发现和鉴定中发挥越来越重要的作用。以宏基因组学（metagenomics）和新一代测序技术（next-generation seqeuncing, NGS）等为代表的分子生物学方法能够从样本中直接分析DNA或RNA遗传物质,在病原鉴定中非常适用。2002年和2012年分别暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）,促使广大研究者密切关注冠状病毒的生物多样性、基因组学和跨物种传播的可能性,尤其是来源于蝙蝠（第二大哺乳动物群体）的冠状病毒。目前已知蝙蝠携带有多种多样的病原体,因此在新发人畜共患病和跨物种传播疾病的监测中,蝙蝠是优先关注的对象。本研究通过泛冠状病毒RT-PCR筛选（pan-coronaviral screening）和新一代测序技术,从棕果蝠（Rousettus leschenaulti）的直肠拭子样本中鉴定出一种新型蝙蝠冠状病毒,将其命名为果蝠冠状病毒GCCDC1 （Rousettus bat coronavirus GCCDC1,Ro-BatCoV GCCDC1）。Ro-BatCoV GCCDC1 在基因组结构和组成上与果蝠冠状病毒HKU9 （Ro-BatCoV HKU9）类似,但是序列和进化分析表明Ro-BatCoV GCCDC1是一种新型蝙蝠冠状病毒。更为引人注意的是,在病毒基因组的3’末端整合有一个独特的基因——p10基因,这个基因在所有已知的冠状病毒中都找不到同源序列,序列和进化分析表明可能来源于一个古老的蝙蝠正呼肠孤病毒。亚基因组mRNA和细胞水平试验表明Ro-BatCoV GCCDC1的p10基因与正呼肠孤病毒的p10基因一样是一个功能基因。在病毒复制周期中,p10基因可能能够促进病毒在细胞与细胞之间转移。这株病毒的发现是单股正链RNA病毒与双股分节段的RNA病毒之间跨科重组的第一次报道。对该冠状病毒的进一步研究能够深入了解病毒间异源重组的机制。蝙蝠冠状病毒HKU9 （Ro-BatCoV HKU9）是一种重要的Beta冠状病毒,系统进化上与MERS-CoV隶属于同一个属。对蝙蝠进行监测的数据表明BatCoV HKU9在蝙蝠群体中广泛流行,因此有必要对这个病毒跨越种间屏障的潜在可能性进行研究。冠状病毒spike蛋白中的受体结合结构域（Receptor binding domain,RBD）识别宿主受体以介导病毒侵入,因此是决定病毒趋向性和传播能力的关键因子。本研究中,通过一系列生物物理和晶体学方法对BatCoV HKU9假定的Spike蛋白RBD进行了研究。表面等离子体共振结果表明HKU9-RBD既不结合SARS-CoV 的受体血管紧张素转化酶 2 （Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2）,也不结合MERS-CoV的受体CD26。我们进一步解析了 HKU9-RBD的分子结构,分析显示该分子结构由一个核心和一个外部亚结构域组成。核心亚结构域的折叠形式与其他Beta冠状病毒RBD的相似,而外部亚结构域在结构上具有独特的特点,仅由一个单一的螺旋组成,这一结构解释了 HKU9-RBD不与ACE2和CD26结合的原因。通过比较目前已知的所有Beta冠状病毒RBD结构,我们进一步提出同源的亚结构域插入结合模式,核心亚结构域和外部亚结构域通过这一模式锚定在一起。通过对HKU9-RBD的结构解析及其与其他Beta冠状病毒的RBD比较,对于阐明Beta冠状病毒受体结合特性及进化规律具有重要参考价值,对于评价HKU9病毒的跨种传播潜力具有重要提示作用。

关键词： 澳门   蝙蝠病毒   冠状病毒   腺病毒   副粘病毒  

摘要： 翼手目(Chiroptera)蝙蝠属于兽类中的第二大类群,是唯一具有飞行能力的哺乳动物,最早出现在5000万年前,目前全球已知的蝙蝠种类超过1200种,广泛分布于地球上的各个角落。蝙蝠被认为是多种人畜共患流行病毒的自然宿主,到目前为止,已经从蝙蝠体内分离鉴定超过180种病毒,这其中有些病毒能引起严重的疾病。尽管我国有针对一些地区的蝙蝠进行采样研究,但是仍不够全面、系统。澳门地区蝙蝠携带流行病毒的情况还未知。澳门是一个国际化都市,人口组成多元化,如果没有有效的防控措施应对突发疫情,局面将会难以控制,因此,调查澳门地区蝙蝠的种群分布和携带病毒的情况十分有必要,可帮助我们认识澳门地区蝙蝠自然携带的病毒种类,为当地蝙蝠源新发病毒的预防和控制提供理论基础。本研究对澳门地区的7个蝙蝠栖息地,进行为期2年的预调查,在这基础上,持续14个月对每个栖息地进行了不连续采样。获得犬蝠、大长舌果蝠、菲菊头蝠、中华菊头蝠、大蹄蝠、日本伏翼、小伏翼、普通长翼蝠、大足鼠耳蝠、扁颅蝠等,共10种蝙蝠的783份粪便样品、220份肛拭样品、和2份尿液样品。对这些样品的流行病学研究结果如下:1.通过PCR检测技术,共从6个物种中检测到50条冠状病毒序列、22条腺病毒序列、2条副粘病毒序列,大部分病毒序列与已知病毒有较高的一致性。检测到的冠状病毒分别与BtCoV1、BtCoVHKU4、BtCoVHKU6、Bt CoVHKU7相关,腺病毒均属于哺乳动物腺病毒,另外,2条副粘病毒序列均与未分类副粘病毒成为一簇。随机挑选207份样品进行了甲肝病毒、戊肝病毒、汉坦病毒筛查,结果均为阴性。在感染率方面,某些病毒的感染率在不同时期有较大的差异。对于冠状病毒,普通长翼蝠(Miniopterus schreibersii)和大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)在夏季的被感染率较冬季高。对于腺病毒,相比其他季节大足鼠耳蝠同样在夏季有较高被感染率。另外,在2015年7月采集的大足鼠耳蝠样品中,普遍存在BtCoVHKU6相关病毒与某一株腺病毒的共感染现象。在使用分子生物学的方法进行物种鉴定时,一份原本被误认为是来自大蹄蝠(Hipposideros armiger)的粪便样品通过细胞色素b两段基因鉴定,结果为大长舌果蝠(Eonycteris spelaea)。通过对检测结果的分析表明,澳门地区病毒感染率较高的物种主要有普通长翼蝠、大足鼠耳蝠和扁颅蝠。2.通过RT-PCR扩增技术获得了10条冠状病毒刺突蛋白(Spike protein,S)基因全长序列和10条RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因全长序列,其中有7条BtCoV1A相关病毒序列,3条BtCoVHKU4相关病毒序列,S基因系统发育分析表明,普通长翼蝠的BtCoV1A与菲菊头蝠(Rhinolophus pusillus)的BtCoV1A来自不同物种,但是亲缘关系也很接近,相似度比对分析表明,在S基因区域,HKU4与MERS-CoV相似度较高,而在RdRp区域,HKU5与MERS-CoV相似度较高。利用高通量测序获得了1株HKU4相关全基因组序列,其各个主要基因均与已知病毒序列有较高相似度。本研究用时间进化树进一步阐述了C世系成员的进化距离,结果提示可能仍有多种蝙蝠源患病毒有待发现。

关键词： 蝙蝠SARS样冠状病毒   反向遗传学   S蛋白   遗传多样性   ORFX基因   天然免疫反应  

摘要： 自SARS暴发后，研究人员在蝙蝠体内中发现大量遗传多样的SARS样冠状病毒(SL-CoV)，包括从中华菊头蝠样品中分离培养的两株病毒WIV1和WIV16，它们与SARS-CoV高度相似，并且能利用SARS-CoV的受体——血管紧张素转移酶2(ACE2)——直接感染人、猴、猪和蝙蝠的细胞，最终证实中华菊头蝠就是SARS-CoV的自然宿主。这些SL-CoV呈现了对人类公共健康的潜在危害。　　分离获得活病毒是研究病毒的致病性和评价潜在危害的关键。本研究结合两种主流的冠状病毒反向遗传学技术（体外拼接和BAC感染性克隆），建立了SL-CoVWIV1的反向遗传学系统。本研究利用体外拼接方法，采用BglⅠ限制酶将WIV1的基因组分割成8个cDNA片段，并在最后一片段3'端加上PolyA序列;利用BAC感染性克隆方法，构建了一个类似的BAC(Bacterial Artificial Chromosome)载体，使载体上带有CMV启动子、HDV核酶和BGH转录终止信号;然后将8个cDNA片段通过一次连接反应插入BAC载体，经多重PCR和限制性酶切图谱鉴定，经济、高效地构建了WIV1的BAC感染性克隆。将BAC感染性克隆转染细胞便拯救了重组病毒。　　利用建立的反向遗传学技术，本研究选择了遗传多样的12株蝙蝠SL-CoV的S基因，将它们替换到WIV1的基因组骨架上，成功拯救了其中4株S基因嵌合重组病毒，包括SL-CoV Rs4231，Rs4874，Rs7327和RsSHC014。首先，本研究测定了这些嵌合病毒利用人、果子狸、蝙蝠ACE2入侵细胞的效率，发现除Rs4231不能利用蝙蝠ACE2入侵细胞有效复制，其他病毒对三种来源受体都能高效利用。然后，本研究测试了针对SARS-CoV RBD(Receptor Binding Domain)的抗体对WIV1和RsSHC014毒株的交叉中和作用，发现大部分抗体能中和WIV1，但不能中和RsSHC014，并意外发现一株单抗31H12对这两个毒株都有中和效应。　　前期本实验室分离培养的两株SL-CoV WIV1和WIV16都编码了一个新的阅读框（命名为ORFX）。本研究探索了ORFX的功能，发现ORFX是一个功能基因，表达为第7条亚基因组mRNA，但对病毒复制不是必须基因。初步研究发现ORFX可能参与调控宿主细胞的天然免疫反应，抑制干扰素的表达，激活NF-κB并上调其下游基因。

关键词： 病毒感染   Ⅰ型干扰素   炎症应答机制   生物学功能  

摘要： 蝙蝠是多种病毒的天然宿主，这个观点已经被越来越多的学者认可。然而对于蝙蝠和病毒能够和平共处的原因，至今还不是很清楚。其中的一个假设是蝙蝠在应对病毒感染过程中存在一些特殊的免疫应答机制。基于此，我们开展了蝙蝠应对病毒感染的干扰素和炎症应答机制的初步研究。　　首先，我们用病毒感染或干扰素和炎症反应的刺激物刺激来自鼠耳蝠的肾细胞，通过定量PCR检测干扰素和炎性细胞因子的表达。结果显示病毒感染后可快速诱导蝙蝠细胞产生强烈的干扰素上调，而炎症反应则没有明显的上调。病毒类似物polyI∶C和炎症反应诱导剂LPS刺激其它蝙蝠原代细胞和巨噬细胞得到了相似的结果。尤其是炎症风暴中重要的炎症因子IL-1β在所有条件下的表达都很微弱。为了进一步证实蝙蝠IL-1β诱导表达的特殊性，我们比较了不同刺激物刺激和病毒感染蝙蝠和小鼠巨噬细胞后IL-1β的表达。结果显示在所有诱导条件下蝙蝠IL-1β的表达水平均显著弱于小鼠。而蝙蝠IL-1β的本底表达水平比小鼠高了几千倍。该结果暗示蝙蝠IL-1β可能具有独特的转录调控机制，使其在生理和诱导条件下的表达异于其它哺乳动物。　　随后，我们克隆了鼠耳蝠NLRP3基因，研究它对炎症小体的激活及IL-1β蛋白加工的影响，并和人源NLRP3进行比较。我们总共得到三种蝙蝠NLRP3剪切体，其中缺失EXON7的剪切体可能是蝙蝠物种所特有。在细胞内超量表达蝙蝠和人NLRP3，结果显示蝙蝠NLRP3形成聚集点的能力及促进IL-1β蛋白分泌的能力均弱于人源NLRP3，暗示这可能是蝙蝠被病毒感染后不表现明显临床症状的原因之一。　　其次，本课题还对IRF3和IRF7在蝙蝠细胞Ⅰ型干扰素生成过程中调控作用进行了研究。序列分析结果表明鼠耳蝠IRF3和IRF7与其它哺乳动物具有相似的功能结构域。双荧光素酶实验证明蝙蝠IRF3和IRF7在干扰素生成过程中发挥重要的作用。但与人和老鼠不同的是，鼠耳蝠IRF7在不同组织中均有表达。IRF7在组织中的广泛表达可能有助于蝙蝠快速的激活干扰素应答反应。　　最后，为研究蝙蝠干扰素下游的干扰素调节基因(interferon regulated genes，IRGs)在抗病毒中的作用，我们利用CRISPR技术成功构建了IFNAR2缺失的中央狐蝠肾细胞系，通过转录组鉴定了IFN-α3下游的基因表达谱，并证明IFNAR2对IFN-α3信号通路及抗病毒是必不可少的。转录组结果中除已知的具有多种生物学功能IRGs外，我们还发现许多未知的IRGs，生物信息学分析显示这些IRGs可能与癌症相关。该研究有助于进一步了解蝙蝠免疫系统，构建的IFNAR2缺失细胞系可以作为研究病毒-蝙蝠相互作用强有力的工具。

关键词： 蝙蝠流感病毒   反向遗传操作系统   分子生物学特性  

摘要： 蝙蝠是世界上种类极为丰富的哺乳动物,将近有1200多个不同的种类,分布在除了两极外世界的各个地区。蝙蝠也是重要的病毒携带者,能够携带至少170种病毒。2012年研究人员在蝙蝠身上发现了H17N10亚型蝙蝠流感病毒。蝙蝠是否是流感病毒的宿主之一,尚不清楚。在基因组结构方面,蝙蝠流感病毒与其它甲型流感病毒有许多相同的地方,也有许多不同的地方。人们掌握了H17N10亚型流感病毒的序列结果,但H17N10亚型流感病毒还不能利用实验室的方法重组得到。本研究利用反向遗传操作技术将H17N10亚型流感病毒内部基因分别与H9N2亚型、H1N1亚型流感病毒携带蝙蝠流感病毒包装信号的表面基因进行重组,拯救出重组蝙蝠流感病毒,分别命名为cH9cN2/H17、cH1cN1/H17。为了研究拯救病毒在MDCK细胞和DF1细胞中的生长规律,将cH9cN2/H17、cH1cN1/H17以MOI(感染复数)为0.001病毒量分别在MDCK,DF1细胞上进行接种病毒。分别在接种病毒后12h、24h、36h、48h收取病毒液,之后进行病毒滴度(TCID50)测定。表明,重组蝙蝠流感病毒cH9cN2/H17、cH1cN1/H17在MDCK细胞、DF1细胞中生长36h时,病毒滴度达到最高。为了研究这两株病毒在小鼠体内的生物学特性,10TCID50的病毒量滴鼻感染小鼠,结果表明,将重组蝙蝠流感病毒cH9cN2/H17、cH1cN1/H17鼻腔接种五周龄小鼠,不会引起小鼠体重下降等异常,也不导致小鼠死亡。但在接种病毒后3天、5天剖杀的小鼠肺脏中检测到较高的病毒滴度。在小鼠体内接种重组蝙蝠流感病毒cH9cN2/H17、cH1cN1/H1715天后分离小鼠血清,可以检测到小鼠血清转阳。本研究成功利用反向遗传操作系统重组了蝙蝠流感病毒,对重组蝙蝠流感病毒在MDCK细胞、DF1细胞的相互适应提供一定的参考依据,为进一步研究蝙蝠重组流感病毒的致病性等奠定了基础。并对cH9cN2/H17、cH1cN1/H17在小鼠体内的生物学特性进行探索,为流感病毒的传染性,致病性研究提供了支持。

关键词： 逆转录病毒   序列   家族   研究者   基因组   家系   染色体组   PNAS   化石记录   蝙蝠   机体  

摘要： 近日,一项刊登在国际杂志PNAS上的研究报告中,来自格拉斯哥大学和捷克科学院的研究人员通过研究在蝙蝠的基因组中发现了引发罕见类型白血病的病毒家族的古老DNA痕迹,这或许就填补了研究者关于逆转录病毒化石记录研究的关键缺口,研究者表示,这些病毒生活在距今2000万至4500万年前。

关键词： 蝙蝠   丝状病毒   核蛋白   间接ELISA   交叉反应  

摘要： 丝状病毒(Filovirus)属于单股负链RNA病毒目(Mononegavirales),目前包括三个属,分别为埃博拉病毒属(Ebolavirus)、马尔堡病毒属(Marburgvirus)和库瓦病毒属(Cuevavirus),前二个属主要分布于非洲,后一个属分布于欧洲。丝状病毒,对人具有高度的传染性和致死性,所以国际上将该科一些成员列为潜在的生物战剂,例如扎伊尔埃博拉病毒(Zaire Ebola virus,ZEBOV)和马尔堡病毒(Marburgvirus,MARV)。除了雷斯顿埃博拉病毒(Reston Ebolavirus,REBOV)的自然宿主是猪以外,其余已知的埃博拉病毒、马尔堡病毒以及库瓦病毒的自然宿主是蝙蝠。我们实验室于2015年首次在亚洲(中国云南省)发现了新型蝙蝠丝状病毒,说明亚洲地区的蝙蝠也有丝状病毒的分布,但其种类、感染率以及公共卫生意义尚不明确,而我国蝙蝠种类和数量繁多,因而建立一种快速、高效和准确的蝙蝠丝状病毒感染血清的检测方法并以此开展血清流行病学调查具有十分重要的科学意义。本研究为了建立检测MARV、REBOV、ZEBOV、库瓦病毒(Lloviu cuevavirus,LLOV)以及新型丝状病毒DH04株的血清抗体间接ELISA方法,首先构建以上五种病毒核蛋白(NP)羧基端的原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,结果MARV、REBOV、ZEBOV和DH04四种病毒NP蛋白表达成功,鉴定为可溶性蛋白,并可与Anti-His单抗进行特异性反应,说明蛋白表达正确。然后,分别以纯化的目的蛋白为抗原包被96孔ELISA板,建立了检测四种病毒血清抗体的间接ELISA方法:优化抗原包被量为2μg/ml、封闭液为5%脱脂奶粉、二抗稀释度为1:20000。建立的ELISA方法与一种蝙蝠轮状病毒、三种蝙蝠和人的布尼亚病毒(来宾病毒、汉城病毒、春山病毒)蝙蝠感染血清均无交叉反应,证明特异性良好;并能检测1∶1 600稀释的阳性血清,说明敏感性良好;试验的批内及批间变异系数均小于10%,重复性良好。用建立的间接ELISA方法检测了云南、广西以及浙江3个地区的蝙蝠血清,总体阳性率为45.2%(141/312),其中云南阳性率明显高于其它两个省份(P<0.05),浙江与广西的阳性率无明显的统计学差异。云南阳性率为65.7%(94/143),其中与DH04、REBOV、ZEBOV和MARV反应的血清分别占46.9%、36.4%、29.4%和21.0%;广西阳性率26.2%(32/122),与REBOV反应的血清最多,占16.4%,其次是DH04和ZEBOV,分别占10.7%和9.8%,MARV最少,仅占4.1%;浙江阳性率为31.9%(15/47),有27.7%的血清针对DH04反应,6.4%的血清针对ZEBOV反应,4.3%的血清针对MARV反应,2.1%的血清针对REBOV反应。根据ELISA检测结果,挑选75份蝙蝠血清,其中59份阳性血清,16份阴性血清,进行Western blot(WB)检测,发现ELISA检测为阳性的蝙蝠血清与WB检测的符合度在80%-100%之间,ELISA检测为阴性的血清与WB检测的符合度在78%-94%之间。使用单抗进行交叉反应确定,证明DH04不与REBOV、ZEBOV、MARV的抗体反应,MARV与REBOV、ZEBOV之间有较弱的交叉反应,REBOV和ZEBOV之间有很强的交叉反应。本研究成功表达了DH04、MARV、REBOV和ZEBOV的NP羧基端蛋白,在此基础上建立了检测四种丝状病毒感染血清抗体的间接ELISA方法,并对我国南方蝙蝠血清进行了丝状病毒的血清流行病学调查,结果表明我国蝙蝠存在比较广泛的丝状病毒感染,而且可能存在多种丝状病毒混合感染的情况,同时不同病毒在不同地域和蝙蝠种类上具有一定的特征:在云南和浙江DH04流行最广,而在广西REBOV流行最广;棕果蝠阳性率显著高于其它四种蝙蝠,马铁菊头蝠中针对DH04反应的血清最多,小黄蝠中针对REBOV反应的血清最多,而在南长翼蝠中未检测到阳性血清。本研究提示我国面临蝙蝠将自身携带的丝状病毒传播给其它动物的潜在风险,为了防范蝙蝠源丝状病毒病未来需要加大对蝙蝠丝状病毒病原的监测和防范措施的研究力度。