关键词： 蝙蝠   冠状病毒   血清学   分子流行病学  

摘要： 研究背景和目的 SARS爆发后,蝙蝠作为多种人兽共患病病毒的自然宿主越来越引起人们的重视。 1.蝙蝠种类多,分布广 蝙蝠隶属翼手目(Chiroptera),是哺乳类中分布最广、数量最多的动物之一,全世界大约有17科180属,约960种,其中我国有7科29属107种。翼手目分两个亚目:大蝙蝠亚目(Megachiroptera),又称狐蝠,我国有1科5属7种;小蝙蝠亚目(Microchiroptera),即通常所说的蝙蝠,我国有6科24属100种。 除南北极外,蝙蝠在世界各地都有分布,包括在高纬度地区、荒凉的沙漠和孤立的岛屿上,甚至在撒哈拉大沙漠也有蝙蝠的活动。然而,大多数蝙蝠种类生活在热带和亚热带地区。蝙蝠物种丰富,分布广泛,寿命长,并有很强的飞行能力,其中一些蝙蝠种类还有长途迁移的习性。 蝙蝠与人类接触密切。有些蝙蝠就栖息在屋檐下,或是房屋的裂缝中;另外蝙蝠在觅食时经常会误闯入居民家中;一些旅游景点的岩洞中也居住有蝙蝠。在中医里面,菊头蝠的粪便被做成“夜明沙”用于治疗眼疾;在广东,果蝠被一些餐馆作为野味摆上餐桌;湖南一些地区则相信蝙蝠可以用来治疗癫痫。 2.蝙蝠与冠状病毒 2002～2003年爆发的SARS,在确定SARS冠状病毒(SARS-CoV)的动物源性后,香港大学微生物系和中科院的研究人员分别发表文章宣布从菊头蝠科的蝙蝠中检测出蝙蝠SARS样冠状病毒(Bat-SARS CoV),与人SARS冠状病毒的核苷酸同源性＞88%,并且从菊头蝠科的成员中检出很高的抗体阳性率。因此,研究人员将冠状病毒的自然宿主锁定在蝙蝠上,并对野生蝙蝠展开了一系列的研究,结果发现,蝙蝠所携带的冠状病毒基因多样性极其丰富,迄今为止已经从蝙蝠中发现了十几种新的冠状病毒。但是通过对冠状病毒与宿主受体结合的S蛋白基因编码区的同源性分析表明,bat-SARS CoV与SARS-CoV S基因的同源性仅为64%,因此,SARS-CoV的直接祖先还未被发现,其从感染动物宿主到感染人宿主的进化历程还没有完全搞清楚,对已发现的冠状病毒进行的系统进化分析也表明还有更多新的冠状病毒没有被发现,现在已知的可能只是自然界中的冠状病毒一个很小的子集。 鉴于蝙蝠携带冠状病毒基因型多态性丰富,以及蝙蝠的生态学特性,期望从中发现其他与SARS-CoV更为同源的冠状病毒,描绘出病毒在自然宿主中的详细进化历程,有助于预防和控制SARS的再次爆发流行。因此,我们从海南、广东和湖南省部分地区收集蝙蝠标本,利用免疫学和分子生物学检测技术对蝙蝠携带冠状病毒进行一次初步的分子流行病学调查。 研究方法 1.蝙蝠标本的收集和处理 2007年5月至8月之间,在海南、广东和湖南省部分地区共收集蝙蝠468只,进行编号后,请广州大学生命科学院蝙蝠研究专家吴毅教授进行鉴定。采集蝙蝠的地方主要有废弃的房屋,或者房屋的缝隙、屋檐,以及野外阴湿的山洞。 ①血清的采集。主要用两种方法,后肢静脉采血和心脏采血。采集的血样4℃静置5h后,3000r/min离心10min,取上清,装在EP管中,编号,4℃运送回实验室,立即检测。 ②直肠样本的处理。通过无菌操作解剖蝙蝠,取肛门上端直肠组织标本约2～3cm,保存在含有RNA1ater的冻存管中,4℃运输,回实验室后,立即检测或放入-70℃保存。 2.蝙蝠血清冠状病毒抗体的SPA-ELISA检测 ①利用葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus protein A,SPA)能够天然地与人及某些哺乳动物的IgG分子上的Fc片段结合的特性,建立了一种新的SPA-ELISA方法,用于检测蝙蝠血清冠状病毒抗体; ②利用建立的SPA-ELISA对海南、广东和湖南部分地区收集的蝙蝠血清进行检测。 3.蝙蝠肠道冠状病毒的RT-PCR检测 ①参考文献,以及对已知的冠状病毒序列进行比对,找到冠状病毒的保守序列设计引物。引物扩增的目的基因位于RNA依赖的RNA多聚酶编码区,能够扩增已知的大部分冠状病毒,包括蝙蝠冠状病毒; ②利用RT-PCR检测蝙蝠直肠样本中的冠状病毒。 4.测序和基因分析 ①对于扩增获得的目的基因进行测序; ②测序结果利用GeneBank的BLAST软件进行在线同源性分析; ③在GeneBank下载其他冠状病毒序列,利用Clustal W进行多序列比对分析; ④用MEGA 4.0软件,采用Neighbor-Joining法,Jukes-Cantor模型做进化树分析。 5.质量控制 ①枪头、EP管、冻存管、手套等实验耗材均为一次性用品; ②逆转录过程采用的枪头、EP

关键词： SARS样冠状病毒   狂犬病毒   蝙蝠  

摘要： 目的了解广西岭景镇某山村蝙蝠携带SARS样冠状病毒及狂犬病毒的情况。方法对广西岭景镇某山村开展流行病学调查,捕捉蝙蝠,采集咽拭、肛拭及粪便标本,进行RT-PCR和细胞分离培养检测狂犬病毒(Rabies virus,RV)、SARS样冠状病毒(SARS-like Coronavirus,SARS-like-CoV)。结果本次调查收集了4只犬蝠(Cynopterus sphinx)、6只普氏蹄蝠(Hipposideros pratti,)和7只中菊头蝠(Rhinolophus affinis),在采集的标本中未检测到SARS样冠状病毒及狂犬病毒。结论未发现调查的3种蝙蝠携带SARS样冠状病毒及狂犬病毒。

关键词： 狂犬病毒   蝙蝠   流行病学   系统发生   间接免疫荧光  

摘要： 狂犬病是由狂犬病毒（Rabies virus，RABV）引起的一种人兽共患自然疫源性疾病，死亡率几乎为100％。在发达国家，人的狂犬病已极为罕见甚至完全消除，犬已经不再是狂犬病传播的主要媒介。我国人狂犬病的发病数位居世界第二，2002年以来年度发病及死亡人数均超过2000例，是严重危害我国公共卫生安全的重要疫病。从建国初至今，我国对动物狂犬病未进行过系统的流行病学统计。因此针对狂犬病的自然宿主——蝙蝠开展RABV的病原生态学研究，对于阐明我国蝠源RABV的分布及遗传衍化关系具有重要意义，对于预警、减少或消灭狂犬病对人类的威胁，具有重要的公共卫生意义。 正确的狂犬病流行病学研究方法离不开制定合理有效的调查程序，包括样品的采集、背景资料的收集整理、研究方法的选择和研究结果的分析。为了获得中国部分地区蝙蝠狂犬病的流行资料，我们首先制定了蝙蝠狂犬病流行病学研究的样品采集方案，依据卫生部发布的人狂犬病疫情公报，将南方狂犬病高发区确定为重点调查采样的地区。最终在中国南方4省（广东省、广西省、云南省和海南省）14个地区和北方吉林省的长春共采集了4科12个蝙蝠品种的1387只外表健康蝙蝠进行了本次病原流行病学调查。至课题完成，共获得蝙蝠脑组织样品1287份，蝙蝠血清样品732份。在上述样品的采／收集时，我们均建立了严格的样品登记制度，详细记录了全部样品的明细档案资料，包括采集当地的狂犬病流行情况、RABV易感动物种群及分布、人文环境等，同时还建立了严格的档案登记制度，详细记录了与样品相关的流行病学信息，这些资料的收集整理对于后期的数据分析以及防控政策的制定都具有重要意义。 引起狂犬病的RABV是弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）的成员，作为单股负链RNA病毒，其核蛋白（N）的编码基因——N基因由于型间相对保守和复制过程中的高拷贝的特点，成为病毒分型和分子诊断的目标序列。现已采用系统发生分析的方法将已发现的RABV确定为7个基因型，此外尚有4种待分型。目前我国狂犬病毒野外分离株仅限于基因Ⅰ型，但是考虑到我国地处欧亚大陆，地理环境和多种野生动物栖息的生态环境，使我们有理由怀疑我国可能存在其他基因型的狂犬病毒，即狂犬相关病毒（Rabies-related virus，RRV）。为了快速完成批量样品／不同品质样品的RABV检测，我们参考了不同基因型狂犬病毒的N基因序列，设计了nested RT-PCR引物并建立了检测方法。灵敏度试验表明，所建立的nested RT-PCR方法可检出0.2TCID50的SRV9细胞毒；灵敏度较MIT法高出100倍。特异性试验表明，本方法可以扩增狂犬病毒的全部基因型的毒株；可供检测的样品包括犬源、牛源、猪源、羊源、蝙蝠源的组织样品，可以用于我国狂犬病毒易感动物带毒的筛查。该方法已在国内多家兽医疾病监控部门应用，反馈效果很好。 通过对所收／采集到的动物样品的病原学检测，获得蝠源RABV N基因部分序列79条，蝠源RABV G基因部分序列19条。检测结果证实，广东蝙蝠脑组织RABV感染阳性率为8.22％（60／730），广西蝙蝠脑组织阳性率为3.72％（11／296），云南蝙蝠脑组织阳性率为7.14％（2／28），海南蝙蝠脑组织阳性率为2.58％（6／233）。在对蝠源RABV序列进行系统发生分析时，我们参考了GenBank收集的我国及世界范围RABV流行株、固定毒株及RRV的基因序列。结果表明，我国蝠源RABV的79条N基因部分序列，核苷酸的最低同源性达81.7％，氨基酸的最低同源性为89.4％。多序列比较证实不同地域毒株间变异的核苷酸位点和氨基酸位点具有明显的规律性；系统发生分析表明，这些毒株归属为三个进化群：Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc；群内地域性特征明显，且同源关系较近。结合参考序列数据，证明我国动物源RABV均为基因Ⅰ型，可以划分为5个群，除蝠源RABV独立的三个群外，其他动物源RABV尚组成2个群；世界蝠源RABV流行株地域性分群明显，群间地域性分布与大陆架结构密切相关，中国流行株在其中表现出明显的地域性与进化程度上的保守性。对蝠源RABV与动物源性RABV G基因的系统发生分析结果表明我国蝠源RABV G基因与我国和其他国家动物源性RABV G基因亲缘关系较远，这可能是我国蝙蝠鲜有传播RABV的原因。 为调查我国蝙蝠感染RABV的情况，本研究利用FITC-Protein A与FITC-Protein G混合物作为荧光二抗，建立了能够检测蝙蝠血清抗体的间接免疫荧光染色法（indirect fluorescent antibody test，iFAT），应用该方法和改良的荧光抗体病毒中和试验（modified FAVN，mF

关键词： 狂犬病毒   禽流感病毒   蝙蝠  

摘要： 目的调查了解广州及周边地区蝙蝠携带狂犬病毒和禽流感病毒的情况，分析蝙蝠与人类相关疾病的关系。方法2004年9月～2005年11月，在广州市及广州市野生动物市场收集来自广州及周边地区的分属2个亚目7个种的蝙蝠共794只：犬蝠（Cynopterus sphinx）330只、普氏蹄蝠（Hipposideros pratti）7只、棕果蝠（Rousettus leschenauh）154只、普通长翼蝠（Miniopterus schreibersi）5只、小黄蝠（Scotophilus kuhlii）52只、中菊头蝠（Rhinolophus affinis）209只及小菊头蝠（Rhinolophus pusillus）37只。收集的蝙蝠分别取得标本；咽拭713份、血清452份、脑组织742份、肺组织742份及直肠组织742份共计3391份，进行RT-PCR和细胞分离培养、检测狂犬病毒（RV）与禽流感病毒（AIV）。结果收集的蝙蝠标本均未检测、分离到狂犬病毒和禽流感病毒。结论广州及周边地区的7种蝙蝠可能未携带狂犬病毒和禽流感病毒。

关键词： 冠状病毒   病毒流行病学   基因多样性   蝙蝠   中国   野生动物   SAILS   生态系统   种间传播   生态学  

关键词： 尼帕病毒   蝙蝠   感染调查   泰国   免疫法检测   病毒RNA   感染情况   抗体阳性   持续感染   IgG  

摘要： 为了了解泰国蝙蝠群中尼帕病毒(首次出现学名宜合称NV)的感染情况,本文作者用酶免疫法检测1304只蝙蝠,结果发现82只蝙蝠体内尼帕病毒Ig G抗体阳性,另在蝙蝠的唾液和尿液中也发现了尼帕病毒RNA,表明尼帕病毒在泰国蝙蝠体内存在持续感染.

关键词： SARS冠状病毒   类SARS样冠状病毒   蝙蝠   流行病学  

摘要： 目的了解野生动物市场果蝠携带SARS冠状病毒(SARS-CoV)和SARS样冠状病毒(SARS-like-CoV)情况。方法2004年9月至2005年11月,在广州及广州野生动物市场收集来自广州及周边地区的分属两个亚目9个种的蝙蝠共905只,有犬蝠(Cynopterussphinx)、棕果蝠(Rousettusleschenaulti)、普通长翼蝠(Miniopterusschreibersi)、普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)、中华菊头蝠(Rhinolophussinicus)、小黄蝠(Scotophiluskuhlii)、大耳双色蹄蝠(HipposiderosPomona)、中菊头蝠(Rhinolophusaffinis)和小菊头蝠(Rhinolophuspusillus)。收集的蝙蝠分别取得咽拭813份、血清524份、肺组织853份及直肠粪便853份标本共计3043份,用新型冠状病毒(N-蛋白)测定试剂盒(酶联免疫法)、SARS-CoVRNA检测试剂盒、荧光PCR及基因芯片检测并通过RT-PCR和细胞分离培养检测SARS-CoV和SARS-like-CoV。结果收集的9个种905只蝙蝠共3043份标本未检测、分离出SARS-CoV和SARS-like-CoV。结论调查的广州及周边地区的9种蝙蝠均未检测到SARS-CoV和SARS-like-CoV。

关键词： 登革病毒   流行性乙型脑炎病毒   蝙蝠  

摘要： 目的了解广东及广西蝙蝠携带登革病毒和流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的情况。方法2004年9月至2005年11月期间11次收集广东及广西部分地区的蝙蝠。收集的蝙蝠取脑组织标本和血清标本,采用两对登革病毒和乙脑病毒通用引物,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞培养分离方法检测所采集蝙蝠标本中的登革病毒(denguevirus,DV)和乙脑病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)。结果收集了4个科9个种共905只蝙蝠,其中棕果蝠154只、犬蝠395只、普通长翼蝠5只、小黄蝠52只、中菊头蝠228只、中华菊头蝠15只、小菊头蝠41只、双色蹄蝠8只、普氏蹄蝠7只。蝙蝠来源于粤中、粤西和桂东的7个县市。905只蝙蝠标本中未检测、分离到登革病毒和乙型脑炎病毒。结论未发现所调查的蝙蝠携带登革病毒和乙型脑炎病毒。

关键词： 蝙蝠   SARS   冠状病毒   自然宿主  

摘要： 蝙蝠是许多新发人畜共患病病毒的宿主库，包括近年来在澳大利亚和东亚地区暴发的亨德拉和尼巴病毒。蝙蝠能携带大量的病毒，但本身并不表现明显的临床症状，意味着蝙蝠可能有不同的方法来清除病毒感染，这使得蝙蝠成为病毒的潜在宿主库。鉴于蝙蝠的这些特性，及其在亚洲一些国家作为餐桌食物，我们在研究SARS-CoV自然宿主时，把目标锁定为蝙蝠。 2004年3月-12月，我们在广东、广西、湖北和天津四个地区采集了3个科6个属9个种共408只蝙蝠的血清、咽拭子和肛拭子样本，用ELISA和RT-PCR等方法进行了SARS病毒抗体和基因的检测。结果表明，菊头蝠(RhinolophidaeRhinolophus)血清呈现了较高的SARS-CoV抗体阳性，以及RT-PCR阳性。并从肛拭子中直接通过RT-PCR获得了一株类SARS冠状病毒(SL-CoVRp3)的基因组全序列。基因组核苷酸序列分析表明，SL-CoVRp3与SARS-CoVTor2病毒基因组序列同源性达92％，二者的基因组结构也非常相似，除S蛋白同源性为64％外，P、E、M和N蛋白的同源性都在96-100％。分子进化分析表明，蝙蝠体内发现的类SARS冠状病毒与人和果子狸体内的SARS-CoV属于同一进化分支，与其它Ⅱ型冠状病毒有显著差异，我们称之为SARS簇冠状病毒。 除了获得SL-CoVRp3的基因组全序列外，还获得了其它4个阳性样本的N、S和ORF8基因序列。利用已有的SARS-CoV和蝙蝠SL-CoV的N、S和ORF8蛋白序列进行遗传进化树分析，结果表明，蝙蝠SL-CoV的遗传变异远远高于来源于人和果子狸的SARS-CoV，意味着引起2002-2003年SARS暴发的病毒可能来源于蝙蝠。 在蝙蝠体内发现与SARS-CoV相似的病毒后，我们利用HIV假病毒系统从分子水平上探讨了蝙蝠SL-CoV和人SARS-CoVS蛋白与ACE2的相互作用关系。我们首先从皮氏菊头蝠(Rhinolophuspearsoni)体内克隆得到蝙蝠ACE2基因序列(RpACE2)，然后构建到Hela细胞形成连续表达ACE2的细胞系。蝙蝠RpACE2大小与人和果子狸ACE2相同(2418bp)，核苷酸同源性为85％，氨基酸同源性为81％。假病毒感染实验表明，无论是蝙蝠SARS样冠状病毒的S蛋白还是人SARS-CoV的S蛋白均不能利用蝙蝠的ACE2作受体，说明蝙蝠SL-CoV的受体与SARS-CoV有很大区别。此外，本研究还获得棕果蝠(Rousettusleschenaulti)和鲁氏菊头蝠(Rhinolophusrouxi)的部分ACE2序列序列，分析发现皮氏菊头蝠和鲁氏菊头蝠氨基酸同源性为94％，它们与果蝠的同源性分别为80％和81％，说明ACE2在蝙蝠不同科属中存在多样性。

关键词： 登革病毒   流行性乙型脑炎病毒   蝙蝠   调查  

摘要： 研究背景和目的 登革热(Dengue fever, DF)和流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE，也称为日本脑炎，简称乙脑)是重要的虫媒病毒传染病，其病原体分别为登革病毒(Dengue virus，DV)和乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)。近年来在东南亚、印度、西太平洋和南美洲大部分地区经常爆发登革热。爆发规模越来越大，情况越来越严重，其中登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)的比例也越来越大。乙脑在亚洲每年有3，000～5，000份临床病例报道，其流行范围也有不断扩大趋势，东起西太平洋岛屿，西到巴基斯坦边界，北起朝鲜，南到巴布亚新几内亚都已经成为乙脑的流行区。 我国DF和DHF的流行也有相当长的历史，甚至可以追溯到1873年。20世纪50年代以前我国沿海大部分地区均发生过DF，此后30多年未发生流行，直至1978年广东佛山再次发生登革4型流行，随后在沿海省份广东、广西和海南等省间断的流行至今。我国乙脑分布在除新疆、青海、西藏和东北北部外的所有省(自治区)。20世纪50～70年代乙脑呈现周期性流行，病例主要分布在东部沿海地区，70年代后，由于大规模使用乙脑疫苗，乙脑发病率明显下降，基本上控制了全国范围的流行。近年来，乙脑报告发病率基本控制在1／10万以下;但目前每年仍发生8，000～12，000左右乙脑病例，局部地区爆发或流行时有发生。 登革热的主要传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊，一般认为，登革病毒主要感染人和低等灵长类动物。在城市型登革病毒感染循环中，病人和隐性感染者是主要传染源。在丛林型疫源地中，猴类动物是主要传染源。但是，也有人认为登革病毒的宿主尚未明确，而且登革热的发病有来无影去无踪的特点，除了