关键词： 病毒宏基因组学   蝙蝠   诺如病毒   正嗜肝DNA病毒   遗传多样性  

摘要： 蝙蝠是世界上仅次于啮齿类动物的哺乳动物,分布于除地球两极以外的其它陆地。蝙蝠常作为许多人兽共患病的自然宿主而被关注。目前已从蝙蝠中发现了超过200种病毒,其中有很多病毒具有显著的公共卫生威胁,比如狂犬病毒、马尔堡病毒、SARS样冠状病毒和尼帕病毒等。我国南部地区经济发达、气候潮湿、温度适宜,适合蝙蝠生存,并且暴发过多起新发传染病,比如登革热、SARS和流感等。为了对福建和广西地区蝙蝠的新发传染病病毒有效地调查,防止蝙蝠病毒跨种和跨境传播给其他动物和人,保障人民生命安全,本课题对这两个地区蝙蝠携带病毒的病原生态学开展了系统的研究,并对新发现的诺如病毒和嗜肝DNA病毒进行了深入的病原学鉴定。本研究于2015年6月至2016年7月,从福建和广西13个市的29个地点共采集到758只蝙蝠样品,蝙蝠品种涉及到蝙蝠科(Vespertilionidae)和菊头蝠科(Rhinolophida的 5 个属,共 16 个种的蝙蝠。通过实验室特色的SVM分析技术,共获得14,014,153条reads,通过基因注释,其中0.65%(90,449)注释到了病毒。其中涵盖了 43个已知病毒科111个病毒属,还包括一些其它未分类的病毒。根据宿主的不同,这些已知病毒分为哺乳动物病毒、昆虫病毒、植物病毒和噬菌体。其中包含18个哺乳动物病毒科27个属、11个昆虫病毒科21个属、9个植物病毒科17个属、6个噬菌体科30个属。在哺乳动物病毒中,重要的有腺病毒科,乳头瘤病毒科,嗜肝病毒科,圆环病毒科,逆转录病毒科,细小病毒科,星状病毒科,呼肠孤病毒科,冠状病毒科,小RNA病毒科,黄病毒科,弹状病毒科,指环病毒科,内罗毕病毒科,汉坦病毒科,杯状病毒科等病毒科的成员。通过对福建以及广西蝙蝠所携带的哺乳动物病毒进行比较分析,发现福建省蝙蝠所携带的病毒包括10个哺乳动物病毒科12个属,广西蝙蝠所携带的病毒包括15个哺乳动物病毒科38个属,说明不同省份的蝙蝠所携带的病毒具有地域性的差异。在宏基因组发现的病毒中,由于诺如病毒和肝炎病毒具有重要的的公共卫生意义,而且它们在福建、广西的多样性特征和分布尚未明确,因此本研究对这2种蝙蝠病毒进行了分子鉴定。诺如病毒是仅次于轮状病毒能够在全世界范围内引起婴幼儿急性暴发性胃肠炎的病原,在发展中国家,每年能够导致约20万不到五岁儿童死亡。目前诺如病毒可分为6个基因群,即GI-GVI,具有明显的遗传多样性。每一个基因群都能够感染多种哺乳动物。根据病毒宏基因组测序结果和进一步的RT-PCR筛查,我们在福建省南平市的62只中菊头蝠中检测到了 2份蝙蝠诺如病毒阳性样品,阳性率为3.22%,对其中一份阳性样品中的诺如病毒进行了全基因组序列扩增,首次成功获得蝙蝠诺如病毒(NPIH26株)的全长基因序列,大小为7,363nt。基因组结构分析表明NPIH26具有典型的杯状病毒单链线性的基因组结构,同方向编码三个蛋白,分别是多聚蛋白,VP1和VP2。部分基因片段的同源性分析发现NPIH26与我国云南的菊头蝠中发现的诺如病毒BtRs-Ca1V/YN2010有最高的核苷酸同源性,为73%。为确定其进化关系,运用VP1基因进行遗传演化分析,把其和诺如病毒的其他六个基因群的成员进行比较,结果显示,NPIH26和BtRs-Ca1V/YN2010组成一个单独的分支,但是和诺如病毒的其它6个基因群不在同一个分支中,遗传距离较远。因此,NPIH26可以被认为是一个新的基因群,即基因7群——GVII。乙肝病毒是嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒属的原型代表,该病毒是人类最具有传染性的病原体之一,每年有88万人死于乙肝病毒感染。2013年,本实验室首次在缅甸的长翼蝠中分离到了蝙蝠肝炎病毒,并且作为一个新的种被ICTV收录。目前正嗜肝DNA病毒属中已经有4种蝙蝠肝炎病毒,这表明乙肝病毒在蝙蝠中的种类比在其他宿主中丰富。为了阐明福建和广西蝙蝠携带肝炎病毒的多样性特征,我们根据病毒宏基因组结果和进一步的PCR筛查,从广西河池采集的3只大蹄蝠中检测到了 2份蝙蝠肝炎病毒阳性,对2份阳性样品中的肝炎病毒进行全序列扩增,序列全长均为3,275nt,两者之间的同源性为99.8%,和从中国龙泉的中华菊头蝠中检测到的Longquan-Ha-273病毒的同源性最高,为96.4%。用全基因组序列进行系统进化分析,本实验中的两株病毒属于一种新的基因型。本研究应用病毒宏基因组学的方法对福建及广西蝙蝠的病毒组进行研究,揭示了该地区蝙蝠携带病毒的多样性特征和地域差异。在此基础上鉴定出新的蝙蝠诺如病毒基因群,并测定了国际上首株蝙蝠诺如病毒全基因组序列。此外,还发现了新的蝙蝠肝炎病毒基因型。本研究对进一步揭示蝙蝠诺如病毒和嗜肝DNA病毒的起源与遗传衍化以及阐明它们的公共卫生意义具有很重要的参考价值。

关键词： 蝙蝠   细小病毒   遗传多样性   圆环病毒   多聚嘧啶串(poly-T)   反向遗传  

摘要： 蝙蝠属于翼手目(Chiroptera),是唯一真正具有飞翔能力的同时也是自然界种类第二多的哺乳动物。蝙蝠被认为是许多重要人兽共患病毒的自然宿主,例如SARS-冠状病毒、丝状病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、肝炎病毒等。本课题组前期通过病毒宏基因组学技术对中国各地蝙蝠携带病毒进行病原生态研究,发现了多种细小病毒和圆环病毒,在种类和数量上体现了丰富的多样性。因此,本课题对我国广西、广东、云南三个省份蝙蝠携带的细小病毒遗传多样性进行研究,同时首次构建了蝙蝠圆环病毒的感染性克隆研究其基因组中特殊结构的功能。细小病毒(Parvoviridae)种类众多,目前有13属60种,其宿主范围广泛,包括多种昆虫和哺乳动物。研究人员曾在蝙蝠体内发现了多株博卡病毒和腺相关病毒,但从未系统研究过。本研究在中国广西、广东、云南三个省份共采集了1311份蝙蝠样品,分别属于狐蝠科、蹄蝠科、蝙蝠科和菊头蝠科。应用高通量测序对其中所携带的病毒进行研究,共注释到病毒序列285788条,其中脊椎动物病毒32272条,植物病毒2049条,噬菌体237912条,昆虫病毒13555条。在脊椎动物病毒序列中,数量最大的是细小病毒,注释到了21809条,遍及细小病毒亚科的8个属。序列分析组装后进行验证,共发现18种不同的细小病毒,PCR检测发现在蝙蝠群体中的阳性率为2.8%-100%。同源性分析显示,该18种蝙蝠细小病毒与ICTV参考毒株氨基酸同源性皆低于85%,全部为细小病毒科新种。对其中的10种细小病毒进行基因组扩增,利用普通PCR和染色体步移(genomewalking)等技术获得了其全部或部分编码区。遗传演化分析显示,该十种新型细小病毒有4种属于Dependoparvovirus属,2种属于Bocaparvovirus属,一种属于Amdoparvovirus属,一种属于Tetraparvovirus属,一种属于Protoparvovirus属,还有一种可能与另一蝙蝠细小病毒构成一个新的属。圆环病毒(Circoviridae)是世界上最小的DNA病毒之一,基因组只有1.7-2.2kb,含有两个主要的开放阅读框。圆环病毒宿主广泛,可以感染哺乳动物、鸟类、鱼、昆虫等,同时一些圆环病毒感染也与人的疾病有关。由于缺少合适的细胞系,圆环病毒很难在体外进行分离培养,无法深入的研究其生活特性和致病性。因此本研究首次构建了蝙蝠圆环病毒感染性克隆,研究其基因组中一段特殊的多聚嘧啶结构(poly-T)的功能。该poly-T由25-29个连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成,位于基因组两个开放阅读框3’基因间隔区。我们构建了两个串连双拷贝的蝙蝠圆环病毒感染性克隆——野生型(wtBatACV)和poly-T缺失型(ΔTBatACV),通过电镜观察和圆环病毒核酸检测证明两株蝙蝠圆环病毒被成功拯救。通过体外转染和间接免疫荧光实验观察,显示两种感染性克隆包装病毒粒的速度、能力没有明显差别,推测该poly-T结构对圆环病毒“生命周期”没有影响。细小病毒和圆环病毒作为两大类小型DNA病毒在自然界中具有非常广泛的分布和多样性。本研究系统调查了我国蝙蝠细小病毒的遗传多样性,在中国南部沿海三个省份不同地区的4个科5个属共17种蝙蝠中,详细调查了细小病毒亚科8个属的细小病毒在蝙蝠中的存在情况,并发现了18种新型细小病毒,为中国细小病毒种类和分布提供了重要的基本数据。同时本研究首次构建了蝙蝠圆环病毒感染性克隆,成功拯救出蝙蝠圆环病毒粒子,从功能上鉴定了其基因组中的poly-T结构,增加了我们对圆环病毒基因组的认识。

关键词： 蝙蝠   汉坦病毒   基因组   遗传多样性   血清抗体检测  

摘要： 汉坦病毒（Hantavirus）是重要的人兽共患病原,能够感染人引起两种严重的疾病:在亚欧大陆主要引起肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）,南北美洲引起汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus cardiopulmonary syndrome,HCPS）。我国是受HFRS危害最为严重的国家,每年10～15万的HFRS病例中,90%以上发生在我国。汉坦病毒属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）汉坦病毒科（Hantaviridae）,病毒粒子呈球形或近球形,直径80～120nm,包裹着大（L）、中（M）、小（S）三个节段的单股负链的RNA片段组成的基因组,总大小约11.8 kb。最新的ICTV第10次分类报告中正汉坦病毒属共包括41个种（Species）。一直以来,啮齿动物被认为是汉坦病毒的自然宿主,但2012年至今,世界各地先后发现9种蝙蝠汉坦病毒,其宿主涉及6个科,分别来自非洲、亚洲和欧洲,呈现出丰富的遗传多样性和生态性,引发了学界对蝙蝠是否是汉坦病毒自然宿主的高度关注。然而,当前蝙蝠汉坦病毒研究存在着缺陷:全基因组序列缺乏、病毒分离不成功、尚未开展系统的血清学调查,直接导致我们对蝙蝠汉坦病毒遗传多样性、致病性以及蝙蝠汉坦与其它汉坦病毒的交叉反应性等了解不够,急需开展进一步研究。本研究中,我们首先利用基于高通量测序的病毒宏基因组学平台,对我国南方地区的蝙蝠进行了汉坦病毒遗传多样性的研究。2012年至2016年,在云南、广西、广东、福建和浙江这5个省和自治区的22个市采集了6科9属22种蝙蝠共1,593只,通过病毒宏基因组学处理和高通量测序,发现其中有413条reads注释到汉坦病毒。RT-PCR检测得到10株汉坦病毒:从广西来宾市和百色市的黑髯墓蝠肺脏组织中检测出1种新型汉坦病毒,阳性率分别为3.13%（1/32）和2.56%（1/39）,命名为来宾病毒（Laibin virus,LAIV）BT20株和BT33株;在来宾市和云南省普洱市的果树蹄蝠肺脏组织中检测出春山病毒（Xuan son virus,XSV）的变种,阳性率分别为9.1%（5/55）和7.5%（3/40）。对检测到的LAIV和XSV的代表性毒株进行全基因组序列扩增,成功测定5株全基因组序列,这也是世界上首次获得的蝙蝠汉坦病毒的全基因组序列。进一步的系统进化和同源性分析表明LAIV和XSV分别分布于广西的黑髯墓蝠和云南、越南的果树蹄蝠群体中,在“广西-云南-越南”一带形成独立的进化群与传播圈。为了阐明我国南方地区蝙蝠汉坦病毒的流行分布和宿主特性,我们进一步针对LAIV、XSV和南方地区流行的啮齿类SEOV进行了血清学流行病学调查。首先分别构建了LAIV BT33株、XSV AR18株和SEOV GuangzhouRn36株的原核表达载体pET28a（+）-rNP,利用IPTG诱导重组NP在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株中的表达,并利用镍(Ni2+)柱进行rNP的亲和层析纯化。为了验证三种病毒间的NP抗原交叉反应性,我们制备了针对这三种汉坦病毒rNP的小鼠高免血清,同时利用293T和BHK-21细胞进行rNP的真核表达,通过其与高免血清的反应说明三种病毒之间能够发生交叉反应。随后,基于rNP构建间接ELISA检测方法,共检测蝙蝠血清样品709份,来自云南、广西、福建和浙江这4个省和自治区的13个采样地点,涉及6个蝙蝠科的8属16种。进一步对88份血清进行Western blotting检测,选择Western blotting与ELISA结果符合率达到最高的OD492值作为Cut-off值（LAIV和XSV为0.10,SEOV为0.11）,以此判定汉坦病毒抗体的总阳性率为18.5%（131份）,其中针对LAIV、XSV和SEOV的抗体阳性率分别为12.7%（90份）、13.1%（93份）和13.1%（93份）。进一步利用SEOV的细胞毒,通过荧光抗体病毒中和试验（FAVNT）对48份血清进行了验证,得到9份阳性血清,确定了血清中汉坦病毒抗体的存在。为了进一步探索蝙蝠汉坦病毒是否具有跨种传播的危险,我们在云南省的红河和文山分别采集健康人血清99份和50份。ELISA检测发现,红河的1份血清针对XSV和SEOV为阳性,阳性率为0.7%（1/149）,WB验证同样对两种病毒有明显条带,且FAVNT显示此血清的中和滴度为1:34。本研究中,我们首次在南方省份系统地开展了蝙蝠汉坦病毒的分子流行病学与血清学研究。通过病毒宏基因组学、基因组测序、遗传演化的研究,获得了我国南方地区蝙蝠汉坦病毒的遗传多样性、阳性率、地域分布等分子流行病学数据。血清流行病学研究和抗原交叉反应性分析发现我国南方省份的蝙蝠普遍存

关键词： 中东呼吸综合征冠状病毒   全基因组序列解析   遗传多样性   刺突蛋白受体   跨种感染能力  

摘要： 蝙蝠是一种种群庞大、分布广泛、种类丰富的哺乳动物。能够携带多种病毒，其中包括能够引起人类严重疾病的人兽共患病毒。有证据显示，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)可能来自于蝙蝠。因此，在蝙蝠中展开MERS相关冠状病毒(MERSr-CoV)的监测，能够为研究MERSr-CoV及其相关病毒的流行情况、演化规律和遗传多样性，预防蝙蝠来源的MERS样疾病提供参考依据。　　本研究针对于2012-2015年采集自广东、广西和四川的1161份蝙蝠样本，通过逆转录PCR的方法，从中鉴定出98份C亚类β冠状病毒阳性。对所扩增的440bp依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)序列进行测序后，得到99株病毒的部分序列。其宿主全部为蝙蝠科蝙蝠。这些序列均属于与已知C亚类β冠状病毒（HKU4-CoV、HKU5-CoV和MERSr-CoV）有亲缘关系的冠状病毒。　　通过传统Sanger测序和Illumina高通量测序法，从上述样本中获得10株病毒的全基因组序列以及28株病毒的RdRp基因和囊膜蛋白(S)基因的全长序列。基因组序列分析表明，10株病毒基因组中，有3株属于HKU4-CoV，3株属于HKU5-CoV，4株属于MERSr-CoV;其中的MERSr-CoV可分为南蝠MERSr-CoV(Ii-MERSr-CoV)和伏翼MERSr-CoV(Pi-MERSr-CoV)两簇。Pi-MERSr-CoV与在我国广东发现的蝙蝠MERSr-CoV-HKU25(HKU25-CoV)高度相似;Ii-MERSr-CoV为一种新发现的MERSr-CoV，也是第一种在南蝠中发现的冠状病毒。基因组核苷酸序列比对表明，新测序的HKU4-CoV与已知序列相似度大于94.9％;HKU5-CoV与已知序列相似度大于95.5％;Pi-MERSr-CoV与HKU25-CoV相似度大于96.4％;Ii-MERSr-CoV与MERS-CoV的相似度为75.3％，与其他蝙蝠MERSr-CoV的相似度为74.7％-81.2％;两株Ii-MERSr-CoV基因组相似度为88.1％，体现了丰富的核苷酸多态性。这些冠状病毒呈现高度遗传多样性。其基因组内发现了多样的重组事件。各病毒的基因均受到负选择压力。这提示这些病毒在其宿主中长期流行。　　本研究进一步分析了其中一株MERSr-CoV BtCoV/Ii/GD/2014-422是否能够利用DPP4作为受体，并初步探究了BtCoV/Ii/GD/2014-422入侵人源细胞的机制。研究结果提示蝙蝠BtCoV/Ii/GD/2014-422可以利用DPP4作为受体。携带其S蛋白的假病毒可以直接入侵人源细胞，而不需要外源胰酶辅助酶切。显示该病毒具有潜在的跨种感染能力。本研究为阐明蝙蝠MERSr-CoV来源于蝙蝠提供了更多证据，同时提示应该建立早期预防措施防止这些蝙蝠病毒的跨种感染引起的疾病。

关键词： 新发传染病   蝙蝠   病毒宏基因组学   汉坦病毒   弹状病毒  

摘要： 背景与目的:病毒是自然界最丰富的物种之一,很多病毒严重威胁人类健康。近年来,新发突发病毒性传染病多次发生,鉴于其高度的不可预测性、突发性、病死率高的特点,极易引起社会群体性恐慌。基于第二代高通量测序的病毒宏基因组学技术直接对环境中所有的病毒核酸序列进行检测,为调查已知和未知病毒提供了高效工具,成为发现新病毒的有效手段。蝙蝠分布范围广泛,是许多病毒的自然宿主,能携带包括多种人兽共患病毒在内的170多种病毒。蝙蝠可以通过中间宿主动物、气溶胶或抓咬伤等方式将病毒传播给人类。我国云南省西南边境与东南亚国家接壤,战略意义突出,是多种病毒性疾病的疫源地,研究发现该地区蝙蝠携带有多种人兽共患病毒。本研究旨在调查云南普洱地区蝙蝠携带病毒的多样性并发现新病毒,对防止野生动物源性病毒,特别是蝙蝠源性病毒传播给人类提供指导意义。方法:在不影响蝙蝠种群延续的情况下,本研究于2016年7～9月在云南普洱各地随机收集84份外表健康的蝙蝠样品,通过PCR方法鉴定蝙蝠品种。利用本实验室建立好的高通量测序样品前处理方法对蝙蝠组织样品处理并进行Hiseq高通量测序;利用生物信息分析平台对测序后的大量数据进行针对性的病毒宏基因组学分析,获得蝙蝠携带病毒的信息。对两种具有潜在意义的新病原进行PCR验证、全基因组扩增、流行病学调查以及病毒分离等相关研究,从而获得该病毒的基因组特征、进化关系以及致病力等生物学特性。结果:(1)84只蝙蝠包括17只中华菊头蝠和67只小蹄蝠。通过对高通量测序数据分析,共得到4,585,938条病毒序列的读长,这些病毒可以划分为38个病毒科150个病毒属。脊椎动物病毒中包含多个具有公共卫生学意义的人兽共患病毒,包括汉坦病毒、博卡病毒和弹状病毒等。(2)从4只小蹄蝠体内分离到一株汉坦病毒DodeHV,获得了其S节段完整的ORF区、M节段的大部分序列和L节段的全长序列,S、M、L基因序列在GenBank中的登录号分别为MG637438、MG637437、MG637436。序列比对表明该病毒序列与越南富寿蝙蝠分离到的汉坦病毒毒株XSV最为相似,二者属同一基因型的不同毒株,但与中国已知蝙蝠汉坦病毒差异较大。(3)从1只中华菊头蝠体内获得了一株弹状病毒DPRV完整的编码区序列,阳性率为在GeneBank中的登录号为MH102387。序列比对表明DPRV是一种新的弹状病毒基因型,在本研究中的阳性率为1.2%(1/48)。动物实验表明DPRV可以感染乳鼠并在乳鼠脑中复制。结论:获得了我国云南普洱地区蝙蝠携带病毒的情况,进一步丰富了云南地区不同品种蝙蝠携带病毒的情况;国内首次在小蹄蝠体内发现了与越南富寿蝙蝠汉坦病毒XSV相同基因型的汉坦病毒毒株DodeHV;国内首次在蝙蝠体内发现了一种新的弹状病毒基因型DPRV,动物实验证明该病毒具有潜在的致病力。

关键词： 蝙蝠流感病毒   禽流感病毒   反向遗传系统   M基因   生物学特性   免疫原性  

摘要： A型流感病毒的M基因可编码M1基质蛋白和M2离子通道蛋白,它们在病毒感染时发挥重要功能。最近先后从蝙蝠体内发现了H17N10和H18N11两种新亚型,据报道在蝙蝠体内能检测到其它亚型的A型流感病毒,其中H9亚型阳性最高,那么同时存在于蝙蝠体内极有可能发生重组,而重组病毒的潜在危害无法预料,因此本实验尝试探索蝙蝠流感病毒与其它亚型重组之后的特性。论文第一部分通过表面基因及M基因的替换、病毒拯救、细胞生长和小鼠致病性试验,发现在MDCK细胞和小鼠体内,哺乳动物来源流感病毒(PR8,Bat17)的M基因较禽源流感病毒(A2093/H9N2)的M基因,可以显著增强嵌合蝙蝠流感病毒的复制能力和致病力;而在DF1禽源细胞上,则反之,禽源M基因替换蝙蝠源病毒(Bat17)的M基因后可以增强其在DF1细胞上的复制能力,这表明M基因是影响嵌合蝙蝠流感病毒致病性的一个关键因素。论文第二部分通过相应的单抗或多抗进行免疫印迹和免疫荧光鉴定Bat和A2093两种亚型的M1、M2基因的原核表达载体和真核表达载体,以及拯救的病毒。结果显示,两种亚型病毒的M1蛋白无论是原核表达、真核表达还是病毒感染其结果一致,而两种亚型的M2蛋白却出现了不一致的结果。这说明两种亚型流感病毒的M2蛋白之间存在免疫原性的差异。因此筛选到了可以区分蝙蝠流感病毒和禽流感病毒的M2抗体,为今后更全面的认识蝙蝠流感病毒与其它流感病毒的差异提供新思路,也为进一步研究流感病毒M蛋白相关的生物学机制提供了基础。

关键词： 埃博拉病毒   扎伊尔  

摘要： 科学家在蝙蝠体内发现了一种新的埃博拉病毒,它也是先于人类而在动物身上发现的第一种埃博拉病毒。人类此前已发现5种埃博拉病毒:扎伊尔、莱斯顿、本迪布焦、苏丹和塔伊森林。除莱斯顿外,其他4种都会在人身上引发严重疾病,尤以扎伊尔病毒最为致命。埃博拉病毒于1976年被发现,其来自何处仍是未解之谜。为了在病毒传播给人类

摘要： 英国《自然》杂志在线发表一篇传染学研究报告称,中国科学家团队发现2017年导致24000多头猪死亡的致命疾病,是一种起源于蝙蝠的病毒造成的,这意味着"庇护"着世界上最致命病毒的蝙蝠们再次成为一种疾病源头。该研究强调,积极监控蝙蝠及其他野生动物中的病毒性感染,对兽医卫生、公共卫生和全球经济具有重要价值。

关键词： MERS-like Beta-CoV viruses   Full genome sequencing   Bats   Italy   Phylogenetic and molecular analyses  

摘要： Background: Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), which belongs to beta group of coronavirus, can infect multiple host species and causes severe diseases in humans. Multiple surveillance and phylogenetic studies suggest a bat origin. In this study, we describe the detection and full genome characterization of two CoVs closely related to MERS-CoV from two Italian bats, Pipistrellus kuhlii and Hypsugo savii. Methods: Pool of viscera were tested by a pan-coronavirus RT-PCR. Virus isolation was attempted by inoculation in different cell lines. Full genome sequencing was performed using the Ion Torrent platform and phylogenetic trees were performed using IQtree software. Similarity plots of CoV clade c genomes were generated by using SSE v1.2. The three dimensional macromolecular structure (3DMMS) of the receptor binding domain (RBD) in the S protein was predicted by sequence-homology method using the protein data bank (PDB). Results: Both samples resulted positive to the pan-coronavirus RT-PCR (IT-batCoVs) and their genome organization showed identical pattern of MERS CoV. Phylogenetic analysis showed a monophyletic group placed in the Beta2c clade formed by MERS-CoV sequences originating from humans and camels and bat-related sequences from Africa, Italy and China. The comparison of the secondary and 3DMMS of the RBD of IT-batCoVs with MERS, HKU4 and HKU5 bat sequences showed two aa deletions located in a region corresponding to the external subdomain of MERS-RBD in IT-batCoV and HKU5 RBDs. Conclusions: This study reported two beta CoVs closely related to MERS that were obtained from two bats belonging to two commonly recorded species in Italy (P. kuhlii and H. savii). The analysis of the RBD showed similar structure in IT-batCoVs and HKU5 respect to HKU4 sequences. Since the RBD domain of HKU4 but not HKU5 can bind to the human DPP4 receptor for MERS-CoV, it is possible to suggest also for IT-batCoVs the absence of DPP4-binding potential. More surve

关键词： ZOONOSES   RABIES virus   NEUROLOGICAL disorders   ENCEPHALOMYELITIS   MICROBIAL invasiveness   VIRUS virulence   RISK factors  

摘要： Rabies is one of the most important zoonotic diseases and is caused by several rabies virus (RABV) variants. These variants can exhibit differences in neurovirulence, and few studies have attempted to evaluate the neuroinvasiveness of variants derived from vampire bats and wild carnivores. The aim of this study was to evaluate the neuropathogenesis of infection with two Brazilian RABV street variants (variant 3 and crab-eating fox) in mice. BALB/c mice were inoculated with RABV through the footpad, with the 50% mouse lethal dose (LD50) determined by intracranial inoculation. The morbidity of rabies in mice infected with variant 3 and the crab-eating fox strain was 100% and 50%, respectively, with an incubation period of 7 and 6 days post-inoculation (dpi), respectively. The clinical disease in mice was similar with both strains, and it was characterized initially by weight loss, ruffled fur, hunched posture, and hind limb paralysis progressing to quadriplegia and recumbency at 9 to 12 dpi. Histological lesions within the central nervous system (CNS) characterized by nonsuppurative encephalomyelitis with neuronal degeneration and necrosis were observed in mice infected with variant 3 and those infected with the crab-eating fox variant. However, lesions and the presence of RABV antigen, were more widespread within the CNS of variant-3-infected mice, whereas in crab-eating fox-variant-infected mice, RABV antigens were more restricted to caudal areas of the CNS, such as the spinal cord and brainstem. In conclusion, the results shown here demonstrate that the RABV vampire bat strain (variant 3) has a higher potential for neuroinvasiveness than the carnivore variant.