关键词：
新病毒
蝙蝠
两栖类和鱼类
病毒宏基因组学
分子流行病学
摘要：
[背景]本世纪以来,新发传染病(EmergingInfectious Diseases,EIDs)在全球范围内频发,从SARS到如今的COVID-19疫情,其中大部分是人畜共患病,约70%以上由野生动物来源的病原体引起,为了量化和降低病原体溢出的风险,全球加强对野生动物携带病毒的主动监测,随着基于高通量测序的病毒宏基因组学技术的兴起,病毒的发现方式发生了变革。作为种类和数目上仅次于啮齿类的第二大哺乳动物,蝙蝠具有长途迁徙、超长寿命、群居活动和强大免疫力等生物和生态学特性,能够携带多种人类致病性病原体,如埃博拉病毒,马尔堡病毒、亨尼帕病毒以及冠状病毒等,因此蝙蝠是重要的人畜共患病毒宿主。我国广东省地处亚热带,人口密集,动物资源丰富,是多种自然疫源性疾病的流行地,因此监测该地区蝙蝠携带的病毒对于有效防范蝙蝠源人畜共患病毒的外溢以及防控新发传染病是非常必要的。另一方面,在脊椎动物携带病毒的监测中,经常存在对哺乳动物和鸟类的抽样偏差,而对于在脊椎动物中占比超过75%的低等脊椎动物——鱼类、两栖类和爬行类携带的病毒却知之甚少。近年来的宏病毒组研究已在鱼类、两栖类和爬行类中发现了多种新型病毒,如流感样病毒、冠状病毒和小RNA病毒等,同时这类动物在养殖过程中不免存在与人类、宠物、禽畜和其他野生动物密切接触的可能,具有传播自然疫源性疾病的潜在风险,因此本研究对我国多个地区的两栖类和鱼类携带的病毒谱进行监测,以进一步丰富低等脊椎动物的病毒资源库,并为病毒-宿主共进化提供理论依据。[目的]1.基于高通量测序的病毒宏基因组学了解我国广东地区蝙蝠携带的病毒多样性,对重要病毒进行PCR检测以掌握其流行情况,并通过系统进化分析了解病毒的遗传进化特征,有助于为蝙蝠源人畜共患病毒和新发传染病的防控提供指导意见,具有深远的公共卫生意义。2.通过病毒宏基因组测序了解两栖类和鱼类的病毒群落组成及携带新病毒情况,描述重要病毒的基因组特征并进行系统进化分析,尝试分离病毒并通过PCR检测了解重要病毒的感染分布情况,对于防范食源性传播以及潜在自然疫源性疾病风险具有重要意义。[方法]1.2015年和2019年分别在广东省肇庆市怀集县和河源市东源县的某些洞穴中采集蝙蝠共120只,混合成10个文库后利用华大MGISEQ-200RS测序平台进行高通量测序获得病毒谱。利用PCR方法检测蝙蝠中与人类致病密切相关的病原体的感染情况,并针对重要病原体进行一系列的基因序列和系统进化分析。2.2021年10月到2022年8月于北京、湖北、四川、吉林、辽宁、云南6个省/市采集两栖类7种和鱼类2种,将两栖类的肺、肠、肝和肾分别混合成35个库,鱼类的鳃、肠和肝分别混合成6个库,进行高通量测序获取RNA病毒谱。通过PCR方法扩增获得病毒基因组,并运用生物信息学软件对其进行病毒基因组结构与功能预测、同源性分析和系统进化分析。同时针对重要病毒设计特异性引物进行PCR验证和检测,了解病毒在两栖类或鱼类中的感染分布情况。利用ACTK-1细胞系分离两栖类中鉴定到的新病毒以了解其生物学特性。[结果]1.广东地区蝙蝠携带病毒多样性的分子流行病学特征1.1蝙蝠样本采集结果本研究在广东地区共采集蝙蝠肛拭子120份,蝙蝠经物种鉴定分为3科5属10种,其中大马蹄蝠数量占比最多(63.3%),菊头蝠的种类数最多(n=5),大马蹄蝠是该地区的蝙蝠优势种群。1.2广东地区蝙蝠携带的病毒谱对蝙蝠肛拭子进行宏病毒组测序,获得107.1 GB核苷酸数据,共注释到18个病毒科,哺乳动物病毒科包括星状病毒科、杯状病毒科、小RNA病毒科、黄病毒科、腺病毒科、圆环病毒科、嗜肝病毒科、细小病毒科、痘病毒科和维雅病毒科共10个,以圆环病毒占比最高(29.6%),不同地区的蝙蝠携带的病毒种类存在一定差异,河源蝙蝠具有更广泛的病毒多样性。1.3蝙蝠中4种重要病毒的分子流行病学特征在120只蝙蝠的肛拭子中检测到了冠状病毒、星状病毒、腺病毒和乙肝病毒,流感病毒和副黏病毒检测均为阴性,菊头蝠属和蹄蝠属蝙蝠携带的病毒谱最广。(1)冠状病毒:在菊头蝠和小蹄蝠中各检出一株新型蝙蝠冠状病毒,分别与SADS-CoV和蝙蝠冠状病毒HKU2具有97%以上的核苷酸同源性,在进化树中各自聚集成簇。(2)星状病毒:星状病毒感染率最高(46.7%),在8种蝙蝠中都有检出,不同种类蝙蝠星状病毒感染率的差异具有统计学意义(χ2=30.526,P<0.005)。12株新型蝙蝠星状病毒之间的氨基酸同源性小于90%,系统进化位置各异,表现出高度的遗传异质性。(3)腺病毒:在菊头蝠和大马蹄蝠中各检出一株新型蝙蝠腺病毒,宏病毒组测序组装还获得一条长37,642 bp的蝙蝠腺病毒Bat adenovirus strain A8,这三株新病毒与已知蝙蝠腺病毒DPol蛋白的氨基酸同源性在69.5
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