关键词： 蝙蝠   桂越边境地区   病毒宏基因组学   小型环状DNA病毒   遗传多样性  

摘要： 蝙蝠是多种新发和再发人兽共患病毒的自然宿主,当前已发现的蝙蝠病毒超过200种。目前我国已发现的蝙蝠有7科33属135种,主要分布于我国华中、华南、西南等人口密集、气候湿热的地区。本课题组前期调查研究表明,广西地区蝙蝠种类丰富且携带多种人兽共患病毒,而新疆蝙蝠种类单一数量较少,所携带病毒也存在明显的地域特征。为了进一步挖掘广西和新疆蝙蝠携带病毒的本底数据和该地区病毒的流行情况,本研究利用病毒宏基因组学对广西11种268只蝙蝠和新疆1种122只蝙蝠样品进行了病毒组学研究,并对蝙蝠小型环状DNA病毒进行检测、全序列扩增和关键蛋白编码基因的遗传分析,以揭示蝙蝠相关病毒跨种跨域传播途径,为防止蝙蝠病毒跨境传播、防范新发病毒病提供了重要的基础数据。通过实验,获得的结果如下;1.通过测序,在2016年广西11种268只蝙蝠样品中获得了 49个病毒科的reads,其中包括了脊椎动物病毒、植物病毒、昆虫病毒和噬菌体,分别占总病毒reads的83.0%、1.2%、0.4%、15.5%。2.对小双节RNA病毒、杯状病毒、多瘤病毒和丙肝病毒等4种病毒的重叠序列进行遗传进化分析发现:(1)广西可能存在2种新的小双节RNA病毒和杯状病毒;(2)多瘤病毒展示了与宿主共进化特征,肝炎病毒在蝙蝠中有着丰富的遗传多样性,可能存在一个变异株。3.对蝙蝠样品中HBV、BcV、RVA、AstV CoV、RV等6种病毒进行检测和进化分析发现:(1)广西蝙蝠携带AstV具有普遍性,出现在了每个采样点和多个蝙蝠品种中;(2)小黄蝠具有复杂的病毒本底,携带有AstV、CoV、RVA和RV等4种病毒,而其它蝙蝠都不超过2种;(3)肝炎病毒株与浙江和贵州的毒株存在着区域相互传播;博卡病毒的进化与宿主有一定的关系;轮状病毒能跨种传播到人,或与人源的轮状病毒发生一定重排;星状病毒能够在不同的蝙蝠中传播、并且也能在蝙蝠和其他动物(啮齿和猪)中传播;弹状病毒与本课题组之前发现的毒株和目前已经报道的毒株显著的进化差异足以使其成为新的病毒属的代表成员;冠状病毒在蝙蝠中具有一定的物种偏向性,CoV-FCRA23与新发现的猪急性腹泻病原体的HKU2或者SADS CoV具有很高的同源性,提示防城港地区养猪业也面临着该病毒的威胁。4.在新疆蝙蝠样品中扩增到1株双环病毒、50株圆环病毒和5株指环病毒基因组全序列,在广西地区样品中扩增到3株双环病毒、3株圆环病毒和8株指环病毒基因组全序列,并通过进化分析发现了2种新的双环病毒、3种新的圆环病毒、4种新的指环病毒。(1)双环病毒:在广西蹄蝠和新疆普通伏翼蝠发现该病毒拓展了其蝙蝠宿主范围;根据ICTV新种的界定,广西3株和新疆1株可能各是一种新双环病毒。(2)圆环病毒:在新疆获得的50株根据编码区域不同分为2种类型,且可能存在1种新的圆环病毒株,其余毒株是该毒株的变异株;在广西蝙蝠中发现3株圆环病毒,属于2种新圆环病毒。(3)指环病毒:在新疆获得的5株可能为1个新种,在广西获得的8株可能为4个新种。本次发现的指环病毒与已报到的指环病毒结构不同,仅仅只包括一个ORF,可能属于一种未分类的环状病毒。结论:(1)利用病毒宏基因组学技术分析了桂越边境地区蝙蝠携带病毒的群落结构,丰富了该地区病毒的本底数据;并分析了小双节RNA病毒、杯状病毒、多瘤病毒和肝炎病毒等10种病毒的遗传多样性及部分病毒的跨种或跨域传播的可能性。(2)通过PCR在新疆蝙蝠样品中扩增到1株双环病毒、50株圆环病毒和5株指环病毒基因组全序列,在广西地区样品中扩增到3株双环病毒、3株圆环病毒和8株指环病毒基因组全序列,并通过多序列比较分析发现可能存在2种新的双环病毒、3种新的圆环病毒、4种新的指环病毒。

关键词： 蝙蝠   宏基因组学   SARS样冠状病毒   跨种传播  

摘要： 近年来,新发传染病(emerging infectious diseases,EID)的频繁发生严重威胁着人类的健康和社会安定,据不完全统计超过60%的新发传染病是来源于动物源性。蝙蝠作为世界上仅次于啮齿类动物的第二大类哺乳动物,在众多重要人兽共患病的发生,流行和传播中发挥重要作用,特别是其作为大量病毒的自然宿主的特性越来越受到科研工作者的重视。我国东南沿海地区是重要的对外交流市场,地处我国东南边陲,物资人口流动频繁,军事、经济战略意义突出。该地区气候温暖、雨量充沛,自然环境适合多种医学生物繁衍,现已知野生动物2000多种宿主动物和医学媒介生物群落异常丰富,是我国自然疫源性疾病多发、高发的地区。加强该地区野生动物所携带病原的监测,鉴定工作,防止野生动物源性(特别是蝙蝠)病原的跨种,跨境传播的可能,对于了解该地区野生动物生物多样性以及防止疾病传播具有重要意义。随着生物技术迅猛发展,以二代测序为代表的宏基因组学技术直接对环境中所有核酸序列进行高通量测序,为调查环境群落的物种多样性提供高效工具,成为发现新病毒的有效手段。为深入了解我国东南沿海地区蝙蝠携带病毒谱信息,本研究通过病毒宏基因组学技术,对该地区2015年-2017年间所采集的蝙蝠标本进行病毒谱调查,并针对其携带的重要病毒蝙蝠源性SARS样冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome-Like-Coronavirus,SL-CoV)展开深入研究。主要研究内容和结果如下:1.宏基因组学研究中国东南沿海蝙蝠携带病毒谱。为了解中国东南沿海地区蝙蝠可能携带的病原种类,本研究基于宏基因测序技术对中国东南沿海6个哨点地区共计235只蝙蝠肠和肺组织进行高通量测序,结果共获得5990261条高质量读长(reads),其中有2975371条reads拼接合并成重叠序列,有631490条重叠序列成功预测为ORF,注释匹配为病毒的ORF占2.37%(15012/631490)。进一步分类整理发现,病毒序列共涉及25个病毒科。包括16个脊椎动物病毒科;4个植物病毒科和5个昆虫病毒科。通过BLAST比对和进化分析提示可能发现新的进化分支的病毒;通过首次在中国东南沿海地区对蝙蝠携带病毒谱的调查,丰富了对蝙蝠作为病原体库的认识,同时为下一步分离培养蝙蝠携带病毒并进一步分析病毒在蝙蝠和人类间传播的可能提供了理论依据。2.重要病原的PCR验证分析。为了验证宏基因测序结果可靠性,根据测序结果,选取与人类致病密切相关且经过BLAST比对后6种病毒(冠状病毒,腺病毒,星状病毒,圆环病毒,诺如病毒,博卡病毒)对所有235只蝙蝠组织核酸进行PCR扩增验证和进化分析。结果不同蝙蝠种类中以菲菊头蝠携带病毒谱最广,分别携带冠状病毒,腺病毒,诺如病毒,圆环病毒,星状病毒,其中以冠状病毒携带率最高,在舟山,长乐,石狮组中检出率为6.8%-18.2%;而在其余蝙蝠种类中,首次在2只大卫鼠耳蝠检测到博卡病毒,一只度赖氏鼠耳蝠中检测到星状病毒。PCR验证结果与宏基因测序结果基本一致,提示宏基因测序技术对于发现环境中新病毒具有指导意义。3.对舟山地区蝙蝠携带冠状病毒进行鉴定研究。本研究运用RT-PCR法对2015年7月至2017年2月间采集的334只蝙蝠进行冠状病毒携带率的调查,结果显示冠状病毒的总携带率为26.65%(9/334)。通过重叠PCR(overlap PCR)和末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)的方法,成功获得了两株SARS样冠状病毒的全长序列,两株病毒株的全长比对分析发现该两株核酸序列之间的同源性高达99%,系统进化分析显示该两株病毒属于β冠状病毒中一个新的分支,这两株新病毒基因组与果子狸SARS冠状病毒(SARS-CoV)SZ3株的总核苷酸序列同源性为81%,低于之前报道的关于中国蝙蝠SL-CoVs的观察结果(88-92%),推测该病毒株为两株新的病毒。4.新鉴定的SL-CoVs病毒株致病力研究。以新鉴定的SL-CoVs ZC45株蝙蝠组织上清感染乳鼠,病理结果显示乳鼠各组织脏器出现炎症反应,且通过脑组织的电镜观察结果发现了冠状病毒样病毒颗粒,蛋白免疫印迹实验(Western blot)分析发现感染乳鼠组织能够和该病毒株核衣壳蛋白N蛋白的多克隆抗体发生反应,从而从抗原性证实该病毒株能够感染乳鼠,通过乳鼠致病实验进一步探讨了该病毒株的跨种传播的可能。综上所述,本研究通过对在我国东南沿海地区3年间采集的蝙蝠进行的宏基因组学测序调查研究,丰富了该地区的蝙蝠携带的病毒谱认识,同时也极大的促进了我们对蝙蝠携带病毒库的多样性的认识;通过我们对新发现的重要病原的鉴定研究,对重要病原的进化关系进行了系统阐述,为该地区蝙蝠携带病毒的基础数据提供了线索

关键词： 急性呼吸综合征冠状病毒   蝙蝠   地理进化   基因检测  

摘要： 蝙蝠是很多新发病毒的自然宿主，其中包括很多人畜共患病病毒。2002年在广东暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)对人类健康造成严重危害。蝙蝠中SARS样冠状病毒(SARS-related CoV)的发现证明了蝙蝠很可能是人类SARS冠状病毒的自然宿主。科学家们还发现能利用人ACE2受体的蝙蝠SARS样冠状病毒以及检测到人感染此类病毒的血清学证据，表明这些冠状病毒在未来对人类存在潜在的溢出风险。因此，持续监测蝙蝠SARS样冠状病毒十分必要。　　从2005年以来，遗传多样的SARS样冠状病毒已经在中国不同地区以及欧洲、非洲和泰国的蝙蝠中被发现，但是它们的多样性、进化和传播尚不十分清楚。非中国国家关于SARS样冠状病毒的分析大多建立于冠状病毒检测的短序列，而基于这个短序列构建的进化树显示来自中国的SARS样冠状病毒相对于其他国家距离人SARS冠状病毒的亲缘关系更近。为了进一步揭示SARS样冠状病毒的进化与传播以及与人类SARS冠状病毒的关系，本研究对实验室已有的2011-2016年在中国二十个地区采集的蝙蝠样品进行SARS样冠状病毒的大规模检测和分析。在这个研究中，我们扩增了全长的RdRp、S和ORF8基因用来做进化分析。系统进化分析显示蝙蝠SARS样冠状病毒和人类SARS冠状病毒亲缘关系最近的RdRp，S和ORF8基因均存在南方家系（云南、广西、贵州、广东和重庆），包括SARS冠状病毒第一次出现的广东，表明了人类SARS冠状病毒的祖先起源于这些南方地区。ORF8和S基因的序列分析显示人类SARS冠状病毒的S基因可能起源于云南的SARS样冠状病毒，同时S基因受到的地理限制性强于ORF8基因。此外，SARS样冠状病毒的S基因在进化过程中发生了频繁的基因重组。病毒与宿主的共进化分析显示SARS样冠状病毒主要在菊头蝠科的同种蝙蝠中进化，而宿主转换主要发生在菊头蝠科的不同蝙蝠物种中。本研究为阐明SARS冠状病毒的地理起源以及蝙蝠SARS样冠状病毒的进化提供了更多的帮助。

关键词： 蝙蝠   迁飞规律   冠状病毒   基因检测   跨种传播  

摘要： 蝙蝠是唯一具有飞行能力的哺乳动物，分布广泛，栖息地多样，并且是许多新发与再发病毒的自然宿主。动物的迁徙能够造成疾病的传播，研究蝙蝠的飞行范围、迁徙路线、迁徙距离、中途停留地点与人类以及家畜活动的交叉区域，可以为预测蝙蝠源病毒的可能传播地理范围提供基础。目前，对飞行动物（鸟、蝙蝠、蜻蜒、蝴蝶等）的监测主要采用标记重捕法、VHF无线电、GPS卫星和雷达监测。在国外，利用上述方法对蝙蝠迁飞进行研究已经开展了几十年并且取得了相应成果，且在澳大利亚曾利用GPS卫星监测果蝠的飞行对亨德拉病毒的传播范围进行研究。而在我国，对于蝙蝠的迁飞研究非常缺乏，对于蝙蝠的迁飞距离、迁飞范围等研究尚属空白。我国幅员辽阔、蝙蝠种类有100多种，蝙蝠携带多种病毒，其中来源于蝙蝠的SARS冠状病毒和SADS冠状病毒曾造成2003年SARS大流行和2016年仔猪死亡。而与MERS相关的冠状病毒也在我国的四川和华南地区有发现。目前研究发现的所有蝙蝠冠状病毒均属于α和β冠状病毒，经ICTV确认的α冠状病毒共17种，其中10种与蝙蝠有关;β冠状病毒共12种，其中7种与蝙蝠有关。因此开展对蝙蝠迁飞的研究对于蝙蝠源病毒的预防和控制具有非常重要的意义。　　冠状病毒基因组是正义单链RNA(+ssRNA)，大小为27～32kb，是基因组第二大的RNA病毒。蝙蝠HKU4冠状病毒(HKU4-CoV)与中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)同属于β冠状病毒、Merbercovirus亚属，二者的非结构蛋白基因序列高度相似，但囊膜蛋白基因差异很大。已有研究结果显示，HKU4-CoV和MERS-CoV一样均能利用人和蝙蝠的二肽基肽酶Ⅳ(DPP4)作为受体入侵细胞。对HKU4-CoV的研究对于蝙蝠源病毒的预防和控制、评估HKU4-CoV向人类跨种传播的可能性有着非常重要的意义。本研究通过查找文献资料整理中国蝙蝠携带冠状病毒及其宿主分布、中国蝙蝠飞行相关数据;通过野外蝙蝠样本采集及形态测量、冠状病毒检测、病毒高通量测序、数据分析等，获得了中国蝙蝠冠状病毒的地理分布、目前国内蝙蝠的迁飞研究情况、10余种蝙蝠的形态学数据，在我国北方同种蝙蝠体内鉴定出蝙蝠HKU5冠状病毒和新型α冠状病毒，获得11株HKU4-CoV基因组。确定了今后在蝙蝠迁飞研究中的蝙蝠物种、研究地点，以及进一步确定HKU4-CoV的遗传特点和可能的跨种传播的潜力。

关键词： 蝙蝠病毒   高通量测序   sRNA   病毒宏基因组学   巨大病毒   沙粒病毒  

摘要： 翼手目（Chiroptera）动物,俗称蝙蝠,该类群具有高度的多样化特征,是哺乳纲动物中的第二大目,仅次于啮齿目（Rodentia）,占哺乳动物的1/4以上,目前世界已正式描述并报道的翼手目种类有2亚目18科202属1134种。迄今为止,已有超过200种病毒在蝙蝠中被检测并报道,并且随着研究的深入还有更多的新病毒在蝙蝠身上被发现。蝙蝠病毒在公共卫生安全上也一度被忽视,在新发现的蝙蝠病毒传染病中,约75%的是人畜共患型病毒。蝙蝠已经被确认是人畜共患病毒的重要自然宿主。我国现正式描述并报道的翼手目有2亚目8科（长翼蝠亚科Miniopterinae独立为长翼蝠科Miniopteridae）140多种,随后近十年内在我国广西、云南、贵州和台湾等地相继又发现蝙蝠新种10余种。其中,云南省翼手目物种数量2亚目7科26属80种及广西壮族自治区翼手目物种数量2亚目7科22属57种,在中国都处于前列,且两地均开展了关于翼手目动物携带病毒的相关研究。据统计目前贵州省翼手目物种数量为2亚目7科19属65种,然而在贵州蝙蝠携带病毒方面的研究还处于空白,为了有效地防控新发传染病的出现或暴发,同时监测外来病传入的风险,因此全面掌握贵州省地区以蝙蝠为自然宿主或中间宿主的病毒本底数据具有非常重要的实际意义。1结果与讨论在本研究中采用病毒宏基因组方法对贵州省境内蝙蝠病毒进行调查,主要的样本是蝙蝠的新鲜粪便,另外采用小RNA病毒检测的方法对同区域内蝙蝠携带病毒进行调查,主要的样本内容是蝙蝠的脏器组织样,包括直肠、肝脏和肺。本研究从菊头蝠科和蹄蝠科中的四种蝙蝠中共检测出53科111属170余种病毒。1.1病毒宏基因组学检测结果本次调查共收集到258份蝙蝠粪便样品（涵括2科6属10种）,其中质检合格进行了后续分析的大蹄蝠样品采样情况:从贵州省9个县市采集到157份粪便样品,占总粪便样品样数量的62.06%。先后分别通过Nt和Nr病毒数据库比对组装得到的406061条Contigs,共得到8149条Contigs是病毒相关序列,占20.07%。对这些病毒序列进一步鉴定分类,可分为49科（包含了Mimiviridae和Pandoravirus）103属。将注释完成的病毒序列按宿主源分类:细菌病毒序列4456条,分布于10科21属,总序列中占比65.13%;昆虫病毒序列998条,分布于8科13属,总序列中占比14.63%;脊椎动物病毒序列975条,分布于23科49属,总序列中占比14.22%;植物病毒序列412条,分布于10科19属,总序列中占比6.02%。1.2 sRNA病毒检测结果小RNA病毒检测方案中从贵州省内采集到蝙蝠样本253份,其中质检合格进行了后续分析的三组样采样情况分别为:皮氏菊头蝠组织样分别从7个县市采集到51份,占总样品总数量的19.77%;三叶蹄蝠组织样分别从2个县市采集到24份,占总样品总数量的9.3%;贵州菊头蝠组织样只在荔波县采集到27份,占总样品总数量的10.47%。通过sRNA病毒检测分析,共鉴定出病毒序列195条,完成分类的有156条,注释得到19科31属73种病毒,其中未做到分类的病毒16种共计39条序列,各组的病毒鉴定情况在后面有详细描述。将注释完成的病毒序列按宿主源分类:脊椎动物病毒序列81条,9科13属,总序列中占比51.92%;昆虫病毒序列13条,3科4属,总序列中占比8.33%;植物病毒序列28条,1科3属,总序列中占比17.95%;细菌病毒序列34条,6科8属,总序列中占比21.79%。1.3贵州省蝙蝠携带病毒的本底构建通过病毒宏基因组学和sRNA病毒检测技术相结合,成功获得了贵州省15个县市的蝙蝠携带病毒的病原生态学的情况,标记出了具有重大流行性病毒种类和巨大病毒在蝙蝠中的新发现病毒种类,为全面掌握贵州省蝙蝠病毒本底提供了重要的基础数据。1.4两种病毒检测技术的比较sRNA病毒检测技术作为在蝙蝠病毒检测中全新的尝试,取得了一定的成果,为今后蝙蝠病毒的研究工作提供了新技术路线,与病毒宏基因组学研究相比较,虽然存在病毒检测范围较窄的问题,但检测高效且准确,且节约经费。根据本研究的采用sRNA病毒检测结果,证实了该检测技术适用快速从样本中检测出多种对脊椎动物具有感染致病性的病毒种类。此外,还证实可用于巨大病毒的检测。1.5不同蝙蝠科病毒多样性分析Shannon-Wiener指数分析得出菊头蝠科蝙蝠与蹄蝠科蝙蝠携带病毒的多样性在科、属、种水平上均存在明显差异,菊头蝠科蝙蝠中携带病毒组成的多样性要高于蹄蝠科蝙蝠。导致出现这种差异的主要原因可能是贵州省这两个蝙蝠科的起源与扩散历史,以及蝙蝠的物种多样性和栖息特征差异。1.6病毒组分分析及公共卫生安全建议成功评估了贵州省蝙蝠携带病毒的丰富度高于同属西南地区的广西和云南两地的特点,且在感染

关键词： 家鼠   鼩鼱   蝙蝠   人双埃可病毒   鼠双埃可病毒  

摘要： 研究背景人双埃可病毒(Human Parechoviruses,HPeVs)是小RNA病毒科(Picornaviridae)双埃可病毒属(Parechovirus)的成员,可导致人的消化系统、呼吸系统甚至神经系统感染。鼠双埃可病毒(Ljungan Virus,LV),也属于双埃可病毒属的一员,其主要宿主是田鼠,但有研究在人血清中检测出其中和抗体。一些小型野生动物如某些种类的鼠、鼩鼱和蝙蝠等常出现在人类居住的环境中,与人接触机会多,有可能成为散播多种疾病的传染源。研究目的了解鼠、鼩鼱和蝙蝠携带HPeVs及LV的情况,为探讨这些动物是否可作为双埃可病毒感染的潜在传染源提供流行病学资料。研究方法1)样本采集2015年9月至2017年6月,在广东省广州市、湖南省益阳市、福建省厦门市,利用捕鼠笼和诱饵诱捕鼠和鼩鼱;2013年11月,在云浮地区捕捉蝙蝠。将捕获的动物经乙醚麻醉后处死并采集其粪便、肝脏、脑组织和咽拭子,分别提取各类标本的总病毒核酸待检。2)种属鉴定利用形态学鉴定方法结合线粒体CytB基因的分子鉴定法确定鼠、鼩鼱或蝙蝠的种属。3)病毒核酸筛查及验证采用巢式PCR对鼠、鼩鼱和蝙蝠标本中HPeV 5'UTR区基因片段进行扩增,筛检阳性样本。利用PCR对样本中LV保守片段进行扩增,检测鼠与鼩鼱标本中LV核酸。4)HPeVs阳性样本中病毒的定量分析使用实时荧光定量PCR(qPCR)的方法测量HPeVs阳性鼠粪便,血清和咽拭子中该病毒的含量。5)分别对鼠与鼩鼱的粪便、血清与咽拭子进行宏病毒组测序。研究结果1)共收集小型野生动物775只,包括鼠421只、鼩鼱108只和蝙蝠246只。2)在421只鼠与108只鼩鼱的肝脏、脑组织和咽拭子标本中均未检测到HPeVs核酸。在246份蝙蝠粪便标本中未检测到HPeVs核酸。3)在421只鼠与108只鼩鼱的粪便、肝脏、脑组织和咽拭子标本中均未检测到LV核酸。4)采用qPCR的方法,发现HPeVs阳性鼠的粪便中病毒含量极低,为1532个拷贝每毫升,其血清中的含量更低,为156个拷贝每毫升。在该鼠的脑组织和咽拭子中均未检测到HPeVs核酸。5)鼠与鼩鼱粪便、血清和咽拭子标本的宏病毒组测序结果表明,虽然小RNA病毒是优势病毒之一,但仅在粪便标本中注释到非常低丰度的双埃可病毒属和HPeVs,且未能在任何标本中注释到LV。研究结论PCR和宏病毒组测序结果提示鼠、鼩鼱和蝙蝠双埃可病毒的携带率或病毒载量极低,本研究未能明确这些动物是否能携带HPeVs和LV,有必要扩大采样规模做进一步研究。

关键词： 蝙蝠   腺病毒   跨种传播   媒介宿主  

摘要： 研究目的近年来,蝙蝠被证实为多种重要人畜共患病毒的储存宿主,由于其具有食性复杂、飞行距离长、与人和家畜关系密切等特点,往往给人类的健康带来极大的威胁。中国东南沿海地区气候温暖湿润,地形复杂多样,是蝙蝠的理想栖息地,同时也是多种疾病的自然疫源地。研究该地区蝙蝠携带的人兽共患病毒,对了解蝙蝠病毒的种类和分布,以及对人群流行的病毒进行溯源等,均具有重要意义。腺病毒(Adenovirus)是无包膜的二十面体病毒,大小约700nm,具有266kb的线性双链DNA基因组。人类由腺病毒引起的疾病包括急性呼吸道疾病,流行性角膜结膜炎等。本研究以东南沿海地区蝙蝠携带的腺病毒为研究对象,通过调查该地区蝙蝠所携带腺病毒的阳性率,对阳性样本进行病毒分离,初步研究蝙蝠源腺病毒致病性及机制,为腺病毒疫情预测预警及下一步研究奠定基础。研究方法1.蝙蝠样本的采集从东南沿海地区(岱山,定海,桃花岛,厦门、长乐等)多个山洞、坑道等采集成年蝙蝠肛拭子和咽拭子,储存在液氮罐中带回实验室,将样本一分为二,一份用于提取核酸,一份放置于-80度保存备用。2.引物设计和样本种群鉴定根据NCBI已报道的蝙蝠腺病毒序列,设计多对引物,对采集的样本核酸进行PCR检测。同时用蝙蝠组织线粒体色素b引物对样本进行序列扩增和种群鉴定。对阳性样本目的片段进行割胶回收纯化,纯化产物送上海生工生物公司测序,测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对。3.病毒的分离将腺病毒阳性样本制备的匀浆接种到6孔板中的Vero E6细胞上。将6孔板在37℃和5%CO条件下孵育2小时以吸附病毒,期间每隔半小时轻轻晃动6孔板帮助吸附。使用新鲜培养基(DMEM)培养细胞,补充2%胎牛血清(FBS)后在37℃、5%CO条件下继续培养2周或出现病变(CPE)。将细胞培养的上清液盲传3次以监测CPE。并根据上述方法接种到Vero E6和其它细胞系上。4.腺病毒对乳鼠的毒力将分离纯化后的腺病毒注射入出生3天的昆明株小鼠脑组织中,一组12只,每只注射100微升,另设两组对照组,一组不做任何处理,一组注射100微升DMEM。在相同条件下饲养2周后,分别取其脑、肝、肾、肺、肠组织脏器并一分为三,一份组织用于核酸提取和病毒鉴定;一份置于4%多聚甲醛中,用于后续免疫组化实验和HE染色实验;一份置于戊二醛溶液中,用于后续电镜观察。结果1.阳性率统计结果从2015至2019间从东南沿海岱山、定海、桃花岛、长乐、厦门等地共采集552只蝙蝠样本,阳性样本36只,总阳性率6.5%。种群鉴定结果显示36只阳性样本皆来自于菲菊头蝠。2.病毒分离在接种阳性样本第7天(盲传第二代)时6孔板中有3个细胞孔出现病变(CPE),PCR检测为腺病毒阳性,继续盲传一代后CPE更明显,PCR阳性也更为明显,电子显微镜下可见明显特征的腺病毒颗粒。将得到的腺病毒液用蚀斑纯化法纯化,得到纯化后的腺病毒储存于-80度冰箱中,用于后续体内实验和深度测序。3.乳鼠攻毒实验3组昆明株乳鼠在相同条件下饲养2周后处死,取脑、肝、肾、肠、肺组织脏器并一分为三,在实验组12只乳鼠肠组织中均检测到腺病毒。两组对照组均为阴性。结论:腺病毒在东南沿海地区蝙蝠中有一定携带率,且存在一定的跨种传播几率和致病性。对东南沿海地区蝙蝠携带腺病毒的流行病和统计学研究具有重要意义。

关键词： 蝙蝠   MHC   抗病毒免疫   多肽呈递   2009pHIN1   H7N9   交叉免疫   T细胞表位  

摘要： 蝙蝠携带许多人畜共患病相关病毒,包括对人类和其他哺乳动物的高致病性病毒。这些病毒的感染通常不会使蝙蝠产生症状,引发了广大研究者对于蝙蝠和其他哺乳动物之间可能存在免疫差异的思考。特别是蝙蝠的适应性免疫特征仍然很大程度上未知,虽然适应性免疫系统中的关键细胞和分子在蝙蝠中是保守和产生功能的,但是在蝙蝠免疫基因中发生了大量独特的氨基酸取代或插入,包括本次研究中的MHCⅠ类分子。我们筛选并解析了一系列MHCⅠ类分子Ptal-N*01:01呈递的蝙蝠来源的高致病性病毒衍生肽复合物:包括亨德拉病毒、埃博拉病毒、MERS-CoV和H17N10流感样病毒。Ptal-N*01:01的结构显示出不寻常的肽呈递特征,α1螺旋的N-末端Met52Asp53Leu54 3个氨基酸的插入和59/65位置的正负电荷匹配组合使得多肽第一位氨基酸Asp紧密的锚定在蝙蝠MHC Ⅰ类分子的A口袋中。作为传统的主要锚定残基位点,Ptal-N*01:01的B和F口袋也显示特殊构象:B 口袋中的氨基酸具有不同的朝向,F口袋显示出对于Pro的偏好性。这些特点导致蝙蝠相比其他高等哺乳动物偏好特殊的多肽基序。有趣的是,蝙蝠MHC Ⅰ类分子的这些特殊的多肽呈递特征可以与不同有袋动物的MHC Ⅰ类分子共享,我们的研究从结构免疫学的角度提供了一个重要参考,有利于了解蝙蝠的适应性免疫和开发针对人类蝙蝠传播的致病病毒的疫苗。不仅仅是针对病毒的来源宿主,对于人类MHC Ⅰ类分子呈递病毒多肽的研究也至关重要。如2009甲型H1N1流感病毒(2009pH1N1)以及发生跨种传播的H7N9禽流感病毒(H7N9)的流行严重威胁了人类健康并造成了重大社会经济损失。自2009年以来,2009pH1N1作为季节性流感的流行使得健康人群存在一定的T细胞免疫本底水平,我们针对2009pH1N1和H7N9的主要T细胞免疫原M1蛋白存在的4个突变区段,利用ELISPOT试验确定了2009 pH1N1在这4个区段来源的T细胞表位多肽四条T细胞表位结果表明在健康人群中存在有限的针对H7N9的预存T细胞免疫,而H7N9在新鉴定表位多肽中的氨基酸突变对于免疫逃逸具有一定的贡献。对流感病毒交叉免疫的研究能够为了解禽流感病毒逃逸T细胞免疫机制以及通用流感疫苗的研发提供重要参考。简而言之,我们通过结构免疫学研究发现了蝙蝠MHC Ⅰ类分子在呈递高致病性病毒多肽过程中的独特特征,并且在进化上更倾向于哺乳动物中的有袋类。为探究蝙蝠携带高致病性病毒却不致病提供了结构免疫学基础。同时,我们针对H1N1中M1蛋白的非保守区段也筛选出了T细胞表位,为流感通用疫苗的开发提供重要参考。

关键词： 新疆   蝙蝠   病毒宏基因组学   哺乳动物正呼肠孤病毒   副肠孤病毒  

摘要： 蝙蝠作为重要的病毒自然宿主,能携带和传播多种人兽共患病毒,例如SARS样冠状病毒、马堡病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒等,这些病毒持续给人类和其它动物的健康带来巨大的威胁。我国是世界上研究蝙蝠病毒最为深入和广泛的国家,目前已经获得了大量的南方地区蝙蝠携带病毒的病原本底数据,这为我国防范蝙蝠源人兽共患病和快速追踪新发病毒的传播源头提供了非常重要的参考数据。然而相对于南方,我们对新疆的蝙蝠知之甚少,关于该地区的蝙蝠病毒的基本数据更是空白。本课题从新疆伊犁州2个地点采集了122只蝙蝠,通过病毒宏基因组学分析,获得的病毒相关的reads为141023条,共注释到了18个病毒科和一些未分类的病毒,这些病毒主要为肌尾噬菌体、短尾噬菌体、长尾噬菌体、腺病毒、乳头瘤病毒、多头瘤病毒、指环病毒、圆环病毒、细小病毒、冠状病毒、星状病毒、黄病毒、微小核糖核酸病毒、双顺反子病毒、传染性软腐病病毒、博尔纳病毒、副黏病毒和弾状病毒。进一步,挑选冠状病毒、圆环病毒、星状病毒、副肠孤病毒和腺病毒等进行特异性PCR检测,发现其阳性率为1.3%-39.1%,其中冠状病毒为alphacoronavirus,相比我国其它蝙蝠冠状病毒,这两株病毒与法国的蝙蝠病毒遗传关系更近,体现了新疆伊犁州蝙蝠冠状病毒与我国其它地方的病毒不同的进化历史;圆环病毒与来自广东、宁夏、江苏和湖北的蝙蝠圆环病毒形成了一个进化分支,说明这群蝙蝠圆环病毒具有很广泛的地理分布;腺病毒与我国其他地方的腺病毒遗传关系较远,体现了进化历史的不同;星状病毒具有丰富的遗传多样性,部分和猪源星状病毒具有很高的同源性,提示可能发生跨种传播;而副肠孤病毒则是首次从蝙蝠中发现。我们首次在蝙蝠中发现了副肠孤病毒,扩大了副肠孤病毒的宿主范围,增加了我们对副肠孤病毒的认识。副肠孤病毒属于小RNA病毒科副肠孤病毒属的成员,分为A型副肠孤病毒-D型副肠孤病毒四种,主要感染人、啮齿动物、鸟类和雪貂。为了更深入的分析蝙蝠副肠孤病毒,我们选取了其中的一个阳性样品对其进行了全基因组扩增,其基因组全长7,174nt,拥有典型的副肠孤病毒的基因组结构。基于多聚蛋白的同源性分析发现,蝙蝠副肠孤病毒与荷兰雪貂中发现的副肠孤病毒的核苷酸和氨基酸同源性最高。用完整的多聚蛋白的氨基酸序列进行进化分析发现,本研究发现的副肠孤病毒与雪貂副肠孤病毒位于同一个小的分支,同属于D型副肠孤病毒。本研究通过病毒分离得到了三株哺乳动物正呼肠孤病毒,哺乳动物正呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的成员。运用电镜观察病毒粒子并通过高通量测序获得了其基因组。三株呼肠孤病毒的基因组均分为10个节段,基于S1基因节段的进化分析发现,本研究发现的哺乳动物正呼肠孤病毒属于哺乳动物呼肠孤病毒2型。本研究首次开展新疆伊犁州蝙蝠病毒的病原生态学研究,通过病毒宏基因组学分析,揭示该地区的蝙蝠携带有大量的病毒并呈现出一定的地域特点。在此基础上首次发现了蝙蝠副肠孤病毒,并获得了其近全基因组序列。此外,还发现了多种新的腺病毒。本研究为掌握该地区蝙蝠携带病毒的多样性提供了重要的基础数据。新疆与多国接壤,蝙蝠的飞翔能力使其很容易跨境迁徙,因此本研究也有助于监测周边国家蝙蝠病毒的本底情况。

关键词： 冠状病毒   密码子   偏性分析   聚类分析  

摘要： 目的探索云南新现蝙蝠SARS样冠状病毒(SARSr-CoV)密码子偏性及其与SARS冠状病毒(SARS-CoV)及其他地区SARSr-CoV密码子偏性的进化关系。方法运用Lasergene、EMBOSS、CodonW等生物信息软件,以SARS-CoV为对照,对云南新现蝙蝠SARSr-CoV各蛋白的编码序列进行密码子偏性分析,并基于此与不同时期报道的SARSr-CoV及SARS-CoV进行聚类分析。结果 11株云南新现蝙蝠SARSr-CoV各蛋白有效密码子数目均接近61,密码子偏性较弱;各蛋白偏性的密码子有差异,但均以A、U结尾的密码子为主。ENC-Plot、中性绘图分析与PR2规则分析均提示新现蝙蝠SARSrCoV在进化过程中主要受到自然选择因素的影响。基于密码子偏性的聚类分析发现,部分云南蝙蝠SARSr-CoV与SARSCoV关系极为密切。同时,其他云南SARSr-CoV分散聚类于其他地区的SARSr-CoV中。结论新报道的蝙蝠SARSr-CoV的密码子偏性与SARS-CoV相似度较高,在进化过程中主要受到自然选择因素的影响,跨种传播至人的风险较高。