关键词： 蝙蝠   细胞色素b   轮状病毒   分离与鉴定  

摘要： 蝙蝠种类众多，其携带的病毒具有一定的物种特异性。为了更好地开展蝙蝠携带病毒的病原生态学研究，建立了一种在核酸水平上准确鉴定蝙蝠种类的方法非常必要。为此，实验通过扩增部分细胞色素b基因序列，准确鉴定了蹄蝠科、菊头蝠科、蝙蝠科、狐蝠科内13种不同的蝙蝠，基于细胞色素b基因序列的系统进化分析支持小蝙蝠亚目的双系起源学说。 蝙蝠是携带人兽共患病毒最多的一种哺乳动物，调查蝙蝠携带病毒的病原生态学本底对防范蝙蝠病毒威胁人类健康具有重要意义。利用病毒宏基因组学分析及RT-PCR方法，本研究在云南勐远县的三叶蹄蝠组织样品中，检测到一份A群轮状病毒（Group ARotaviruses，RVA）阳性肠道组织样品。利用Marc145细胞从阳性样品中，成功分离到一株新的轮状病毒，命名为RVA/Bat-tc/MYAS33/2013/G3P[10]，测序获得了该毒株近乎全长的序列，序列分析表明该毒株基因型为G3-P[10]-I8-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6。多序列比对的结果表明，与MYAS33毒株11个基因片段同源性最高的基因片段主要集中在蝙蝠轮状病毒MSLH14，人轮状病毒CMH079，马轮状病毒E3198，猴轮状病毒TUCH。与MSLH14毒株同源性最高的片段为VP3(94.7%)、 NSP1(93.7%)、 NSP2(95.3%)、NSP5(97.4%)；与CMH079同源性最高的为VP4(94.8%)、VP6(94.3%)、NSP4(97.6%)；与E3198同源性最高的为VP7(92.9%)、VP2(95.4%)；与TUCH同源性最高的为VP1(92.9%)、NSP3(91.4%)。新分离到的MYAS33毒株，与国际上首次报导的蝙蝠轮状病毒KE4582没有任何一个片段的基因型相同；除VP4基因外，其它十个片段与第一株分离的蝙蝠轮状病毒MSLH14基因型相同。收集病毒细胞培养物，在电镜下看到了聚堆的典型轮状病毒粒子。通过PAGE电泳，将新分离到的MYAS33毒株与之前分离的MSLH14毒株基因组11个核酸片段全部分开，并观察到两个毒株的VP6、NSP3、NSP4片段大小差异明显。通过免疫青年昆明鼠，制备了特异性抗MYAS33毒株的多克隆抗体，为后续实验奠定了基础。本研究发现的G3P[10]型蝙蝠轮状病毒，丰富了蝙蝠携带轮状病毒的多样性，且稀有的G3P[10]型轮状病毒是首次在动物体内发现。本研究的发现突显了蝙蝠作为轮状病毒自然宿主的潜在威胁，为轮状病毒的研究提供了重要的数据，对更好的防控轮状病毒病具有重要意义。

关键词： 蝙蝠   分子流行病学   高通量测序   序列分析   Nested RT-PCR   狂犬病毒  

摘要： 蝙蝠种类多,分布广泛,与人类接触密切,是一些重要动物源性疾病的传染源。迄今为止,已在蝙蝠体内分离或者检测到就有70多种病毒。因此,研究蝙蝠携带病毒的种类以及对人可能的危害很有必要。传统的研究方法对于核酸信息未知的病毒往往束手无策,随着分子生物学技术的发展及挖掘新病毒的需求增大,一些不依赖于已知核酸序列研究病毒的方法不断出现,其中一种基于高通量测序的病毒宏基因组学方法越来越成熟。对海量高通量测序数据进行分析是一种挑战,很多实验动辄产生几个TB的数据量,但因为处理能力和存储能力的不足,研究者不得不把绝大部分未经处理的数据丢弃掉或仅做初步分析,对高通量测序数据的深入验证分析仍然是一个难点。近五年来已有5份关于蝙蝠病毒宏基因组学的研究,其中2份研究来自美国,3份来自中国。这5份研究通过454测序或者Solexa测序,发现了大量的蝙蝠新病毒,大大的加深了人们对蝙蝠携带病毒多样性的了解,但是研究蝙蝠种类和数量非常有限。本课题组自2006年在广东、海南、湖南等地蝙蝠携带病毒进行流行病学调查,发现了这些地区的一些蝙蝠能携带一些人类传染病病毒,但逐个病毒检测工作量巨大,也受到常规检测方法敏感性的影响,而且不能发现未知的病毒。因此本研究拟建立基于Solexa高通量测序的蝙蝠组织病毒宏基因组学分析方法,对来自广东的1只大足鼠耳蝠和来自海南的1只长翼蝠的脑、血清以及直肠部位的病毒群落进行探索,以期发现蝙蝠携带的可能与人有关的已知和未知病毒;此外,通过基于高通量测序结果,对蝙蝠样品中的几种重要病毒进行初步验证研究,并开展蝙蝠样本相关病毒的分子流行病学调查。1研究方法1.1蝙蝠标本的采集在广东、海南和湖南部分地区捕捉蝙蝠,进行编号后,请广州大学生命科学院蝙蝠研究专家吴毅教授进行鉴定。通过无菌操作解剖蝙蝠,取完整脑组织和肠道近肛门段标本,用无菌注射器心脏采血,每种组织一式两份。采集的脑、直肠样本存放于含200ulRNAlater储存液的冻存管中,心脏采血收集全血装于EP管中,置放于密封的冰袋泡沫盒中当天运回实验室,放于-80℃冰箱贮存,待检。1.2病毒宏基因组学方法1.2.1组织样本的准备将组织样本旋涡、离心后,收集组织病毒液进行去背景核酸处理,分别采用RNA和DNA病毒提取试剂盒提取病毒核酸后,进行cDNA和单链DNA的补平后混合,应用随机引物对混合病毒核酸进行随机扩增,对扩增产物进行检测后送样建库测序。1.2.2高通量测序由深圳华大基因公司完成,首先采用超声法Covaris将长片段PCR产物随机打断并产生主带小于等于800bp的一系列DNA片段,添加特殊接头后连接,并制成文库,随后应用四种荧光标记的核苷酸通过桥式PCR进行边合成边测序获得原始Reads数据。1.2.3病毒注释和丰度分析首先将获得的重叠序列使用BLASTn和BLASTx在GenBank的非冗余核苷酸序列数据库和美国能源部联合基因组研究所JGI数据库中进行比对,分别取Evalue<10-5或者nt>100的序列作为有意义的序列,然后按照物种注释信息,去除细菌及真核类等其他非病毒序列。1.3几种重要病毒的PCR扩增和初步序列分析在样本RNA提取、逆转录获得cDNA后。根据人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,ScMV)标准序列和宏基因学分析近源参考株设计引物,根据引物特点摸索PCR反应条件,经琼脂糖电泳检测,可疑阳性PCR产物送公司测全序。将测序成功可疑病毒序列用GenBank的BLAST软件进行在线同源性分析,并从GenBank上下载其他相关病毒序列,利用ClustalW进行多序列比对分析。用MEGA4.0软件,采用Neighbor-Joining(邻近连接法),Jukes-Cantor模型做进化树分析,所得进化树用Bootstrap(1000 replicates)法进行检验。1.4蝙蝠狂犬病毒(Rabies virus,RV)的检测参照本课题组马莉珍等已建立的狂犬病毒RT-LAMP方法快速筛查蝙蝠脑组织样本,应用nested RT-PCR方法扩大样本检测蝙蝠脑组织狂犬病毒,以获得狂犬病毒序列,其中nested RT-PCR方法参考文献中引物,以狂犬病毒核蛋白(N)基因最保守区域为目的扩增基因。用狂犬病毒减毒活疫苗作为阳性对照,同时添加空白对照。1.5狂犬病毒N基因片段分析1.5.1狂犬病毒的细胞培养和乳鼠接种实验:将蝙蝠的脑组织悬液经滤器过滤后各取0.20ml接种于BHK-21细胞上,持续观察7天,并设正常细胞为空白对照,盲传3代以稳定毒力。每代

关键词： 蝙蝠   轮状病毒   分离鉴定   系统进化分析  

摘要： 蝙蝠是携带人兽共患病毒最多的一种哺乳动物,调查蝙蝠携带病毒的病原生态学本底对防范蝙蝠病毒威胁人类健康具有重要意义。本研究采集云南省部分地区蝙蝠进行病毒宏基因组学分析,在一组食虫蝙蝠样品中发现了A群轮状病毒(Group A rotaviruses,RVA)序列,经过进一步RT-PCR筛查验证及病毒的分离鉴定,最终从勐远县的1只三叶蹄蝠中分离出一株轮状病毒。扩增该毒株的VP7与VP4基因进行分型与系统进化分析,结果表明其VP7基因为G3型,与来自阿根廷的1株马轮状病毒的同源性最高,为93%;其VP4基因为P[10]型,与来自泰国的1株人轮状病毒同源性最高,为94.8%。通过与本实验室之前分离的首株蝙蝠G3P[3]型轮状病毒MSLH14的比较,确定该毒株为一株新的蝙蝠轮状病毒,命名为RVA/Bat-tc/MYAS33/2013/G3P[10],简称MYAS33。本研究结果进一步证明了蝙蝠轮状病毒的多样性,突显了蝙蝠作为轮状病毒潜在宿主的重要性。

关键词： SARS病毒   蝙蝠   非典型肺炎   冠状病毒   《自然》   论文作者   卫生控制   研究成果  

摘要： 【社巴黎2013年10月30日电】科学家周三说,有证据表明,类似于非典型肺炎（SARS）病毒的冠状病毒可从一种中国蝙蝠身上直接传染给人类,无需其他动物充当＂宿主＂。这项研究发表在《自然》周刊上。论文作者表示,此研究成果对公共卫生控制＂影响很大＂,因为目前在中国蝙蝠身上发现的潜在大流行病毒可能导致另一场疫情暴发。

关键词： ARTIBEUS   RESEARCH   INFLUENZA viruses  

摘要： The article discusses a study on bat Artibeus planirostris performed by Ruben Donis, chief of the molecular virology and vaccines branch at the U.S. Centers for Disease Control and Prevention, which revealed a new flu virus H18N11 and was published in 2013 issue of the journal 'PLOS Pathogens.'

关键词： 蝙蝠   病毒   传播  

摘要： 目的了解蝙蝠携带及传播病毒的研究进展。方法查阅文献,综合分析。结果蝙蝠携带多种病毒,可成为一些人兽共患病毒性疾病的重要传媒。结论必要针对我国蝙蝠进行西尼罗病毒和圣路易脑炎病毒抗体的血清学调查,了解蝙蝠与其吸血蚊虫的生态学关系,以便在未来可能的暴发流行中有效地针对媒介蚊虫进行控制,防患于未然。

关键词： 适应性机制   免疫系统   蝙蝠   飞行   科学家   基因组学   中国科技网   动物研究所  

摘要： 据中国科技网2013年1月9日报道，由华大基因、澳大利亚动物研究所、中科院武汉病毒所、美国海军医学中心及亨利·杰克逊基金会等共同完成的蝙蝠基因组学研究，对两种不同类群的蝙蝠基因组进行比较分析，揭示蝙蝠飞行及免疫系统的适应性机制，阐明不同蝙蝠类群的分子多样性机制，

关键词： 病毒宏基因组学   蝙蝠   病毒组   高通量测序  

摘要： 蝙蝠携带有60多种病毒,其中许多对人有高度致病性。为了解中国蝙蝠携带病毒的自然本底、蝙蝠病毒的多样性和挖掘潜在的病毒病原,通过基于Solexa高通量测序的病毒宏基因组学技术对从吉林、云南、湖南采集的蝙蝠组织进行病毒组学研究,获得了11 644 232条读长(Reads),并拼接出44 872条重叠序列(Contig)。通过核酸序列注释发现,其中8.2%(4 002/44 872)的重叠序列与病毒相关,能进一步注释到36个病毒科,包括19种脊椎动物病毒、6种植物病毒、4种昆虫病毒和4种噬菌体。通过对重叠序列的遗传进化分析、多序列比对显示,被注释为细小病毒、腺联病毒、博卡病毒、腺病毒、小双节RNA病毒等的重叠序列与已知病毒相似,部分序列却又呈现出明显的序列差异。通过对腺病毒和博卡病毒进一步的PCR扩增证实了此研究方法可靠。旨在了解我国蝙蝠携带病毒组的构成,对建立高效的野生动物源人兽共患病的监测方法提供参考。

关键词： 免疫系统   科学家   适应性   蝙蝠   机制   飞行   基因组学   基因组比较  

摘要： 中外科学家完成的蝙蝠基因组学研究近日在《科学》上在线发表。科学家对两种不同类群的蝙蝠基因组比较分析，揭示了蝙蝠飞行及免疫系统的适应性相关机制，阐明不同蝙蝠类群的分子多样性机制，为蝙蝠及其它哺乳动物在生物学及进化等方面的研究提供了新思路。 蝙蝠可携带多种人畜共患病毒，自身几乎不受感染。通过对相关基因的研究，科学家发现蝙蝠中NF-KB家族转录因子C-REI，受到正选择。该基因不仅在固有免疫中发挥功能，