关键词： 狂犬病毒   褐家鼠   蝙蝠  

摘要： 目的了解广东省广州市鼠及蝙蝠狂犬病毒的携带情况,分析鼠、蝙蝠作为人类狂犬病潜在传染源的可能性。方法于2013—2015年在广州市公园、医院以及农贸市场捕获褐家鼠及蝙蝠,无菌采集其脑组织样本,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞培养分离法检测狂犬病毒。结果本次调查共捕获159只褐家鼠、66只蝙蝠(57只犬蝠、9只伏翼蝠),共获225份脑组织标本,RT-PCR和细胞培养分离法未在采集的脑组织样本中检测出狂犬病毒。结论广州市褐家鼠、犬蝠及伏翼蝠作为狂犬病传染源的可能性较小。

关键词： 埃博拉病毒   天然宿主   致命疾病   人员研究   免疫学家   先天免疫   响应机制   工业研究   CSIRO  

摘要： 蝙蝠是超过100种病毒的天然宿主,其中一些病毒对人类的伤害则是致命的,包括中东呼吸综合征（MERS）、埃博拉病毒等,然而这些病毒却对蝙蝠没有影响,这是什么原因呢？目前一项新的研究发现,这或许与蝙蝠独特的＂全天候＂免疫系统有关。科学家认为,可以借鉴蝙蝠的这种能力研究出保护人类不受埃博拉等致命疾病伤害的方法。研究人员通过对澳大利亚黑狐蝠的基因和免疫系统进行检测,获得了一些重要发现。

关键词： 蝙蝠流感病毒   H17N10亚型   NS1基因   原核表达   免疫学活性  

摘要： 本研究通过构建H17N10亚型蝙蝠流感病毒NS1基因(BNS1)的原核表达载体。利用原核表达产物制备小鼠多抗血清,经间接免疫荧光试验检测其特异性。用真核表达载体p3Tag BNS1转染293T细胞进行免疫印迹检测。通过IFA及Western-blot检测,结果显示,BNS1原核表达产物为可溶性表达;BNS1多抗抗血清能与BNS1真核表达产物发生特异性结合;BNS1抗血清具备良好的免疫学活性。利用p RL-TK与p FL-IFNβ荧光素酶报告基因系统检测,结果表明,BNS1与H9N2 NS1均显著地降低IFN-β启动子活性。为下一步深入研究BNS1的生物学功能奠定了基础。

关键词： 博尔纳病毒   蝙蝠   核蛋白   蛋白质免疫印迹法  

摘要： 目的观察贵州遵义地区蝙蝠脑组织博尔纳病毒(BDV)感染情况。方法采用Western blotting法检测贵州遵义地区82只健康蝙蝠脑组织中BDV核蛋白。结果蝙蝠脑组织BDV核蛋白阳性率为12.2%(10/82)。结论贵州遵义地区健康蝙蝠存在BDV感染。

关键词： 云南   蝙蝠   博卡病毒   进化分析  

摘要： 目的进一步发现云南新型蝙蝠病毒,并鉴定云南省蝙蝠携带博卡病毒(bocavirus)的遗传多样性。方法对采自景洪市的26只三叶蹄蝠进行了病毒宏基因组学分析,根据其结果对博卡病毒进行了PCR检测和全基因分析。结果与结论根据检测结果,从3只(11.5%)蝙蝠的肠道中发现了一种新型博卡病毒;通过全基因组扩增和分析,发现该病毒全长5203 nt,编码NS1、NP和VP1/VP2蛋白,分析显示该病毒NS1和VP1基因分别与博卡病毒代表种犬博卡病毒(canine bocavirus)1和犬微小病毒(canine minute virus)有最高的氨基酸序列相似性,达到58.7%和53.3%。依据国际病毒分类委员会病毒新种判断标准,NS1蛋白基因氨基酸序列相似性低于85%,为博卡细小病毒属新种,因而该病毒是一新博卡病毒种;该研究为进一步了解我国蝙蝠携带病毒的多样性提供了参考,同时为研究博卡病毒的宿主范围和进化关系提供了重要的基础数据。

关键词： 蝙蝠   流感病毒   NS1基因   单克隆抗体   免疫学活性  

摘要： 甲型流感病毒属于正黏病毒科，基因组由8个节段的单股负链RNA组成，通过剪切拼接、移码等机制，至少编码14种病毒蛋白。流感病毒亚型分类根据两种主要的表面蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。在鉴定出蝙蝠流感病毒(Bat Influenzavirus，BIV)之前，已有16种HA亚型和9种NA亚型被发现，主要存在于鸟类、水禽体内。在这些病毒中，只有H1N1、H2N2和H3N2能感染人并引起大流行。最近，有两个新亚型在危地马拉小黄肩蝙蝠（叶口蝠科黄肩蝠属）和秘鲁平脸果蝠（叶口蝠科牙买加果蝠属）中被发现可能存在H17N10和H18N11两种新型的流感病毒。\n 非结构蛋白(NS1)是流感病毒中最主要的多功能免疫抑制因子，与双链RNA(dsRNA)结合，导致病毒在复制时dsRNA的减少，从而抑制抗病毒信号传导通路，阻止干扰素-α/β（IFN-α/1β）产生;抑制应激激活蛋白激酶(Jun N-terminal Kinase，JNK)和转录激活因子(Transcription Activitor, AP-1)的激活，导致抗病毒和炎性细胞因子的基因不能正常转录;NS1与视黄酸诱导基因-I(RIG-I)形成复合体，阻止前转录中干扰素的合成。在抗干扰素和其他多种抑制先天性免疫途径中发挥了上调作用。H17N10亚型蝙蝠流感病毒与其他A型流感病毒的NS1具有50％同源性，但BNS1却极可能显示出更强的免疫调节作用。重组H17N10亚型蝙蝠流感病毒NS1（以下缩写为:BNS1）的PR8抗干扰素活性显著被增强。BNS1可结合双链RNA，显著抑制天然免疫反应。\n 本研究通过构建H17N10亚型蝙蝠流感病毒NS1基因的原核表达载体，利用原核表达产物制备小鼠多抗血清，经间接免疫荧光实验(IFA)检测其特异性。用真核表达载体p3 Tag-BNS1转染293T细胞进行免疫印迹检测。通过IFA及Western-blot检测，结果:BNS1原核表达产物为可溶性表达;BNS1多抗抗血清能与BNS1真核表达产物发生特异性结合;BNS1抗血清具备良好的免疫学活性。\n 利用H17N10亚型流感病毒的NS1蛋白原核表达产物免疫Balb/C小鼠，制备单克隆抗体。用真核表达载体p3Tag-BNS1转染的293T细胞作为筛选抗原，间接免疫荧光法筛选单抗，结果获得了5株特异性单抗，分别命名为:5E5、2B1、2D9、4G12、6A11。经间接免疫荧光及免疫印迹检测，结果发现:这五株单抗均有较好的免疫荧光效价;只有5E5和2B1两株单抗的免疫印迹呈阳性反应，其余3株全为阴性结果。分别将H1N1、H5N1、H9N2、H10N8、H10N3、H10N7、H17N10、H18N11亚型流感病毒NS1的真核表达质粒分别转染293T细胞，通过IFA鉴定发现:仅5E5单抗对蝙蝠流感病毒具有特异性。单克隆抗体亚类鉴定显示:2B1株为IgM，其余4株都为IgG2a。为鉴定BNS1单抗识别的抗原表位，构建BNS1截短体质粒，经原核表达，免疫印迹检测，结果显示:2B1单抗针对的抗原表位是30DAPF33，5E5单抗针对的抗原表位是34E。双分子荧光素酶报告系统检测发现:BNS1能够明显抑制IFN-β启动子活性。NS1单抗的制备对研究该蛋白功能及结构有重要意义，这为下一步深入研究BNS1的生物学功能奠定了基础。

关键词： 蝙蝠   分子流行病学   高通量测序   疱疹病毒   腺病毒   轮状病毒   乳头状瘤病毒   反转录病毒   序列分析  

摘要： 蝙蝠是巨大的病毒库,有关蝙蝠携带“新”病毒的研究逐年增加,正不断地补充其病毒库的构成。消化道,作为开放性的腔道,沟通蝙蝠与外界环境,为疾病的传播提供可能。目前,关于蝙蝠携带腺病毒、疱疹病毒、轮状病毒、乳头状瘤病毒及杯状病毒已见文献报导,但多见于其他地区,中国境内少见报导或缺乏流行病学资料,各个研究中收集的蝙蝠种属比较单一。定期对各个地区,不同蝙蝠种属进行病毒检测,有助于了解蝙蝠-病毒间的宿主-病毒关系及其病毒的进化情况。本研究拟对来自广东广州、惠州、云浮以及海南海口四地的520份蝙蝠粪便及直肠标本携带的腺病毒、疱疹病毒、轮状病毒、乳头状瘤病毒、杯状病毒及细小核糖核酸病毒进行流行病学调查及进化溯源分析。已有研究表明蝙蝠的脑、肠道、肺脏、肾脏、肝脏及血液中携带各种各样的病毒。但以往的研究对特定病毒的检测多采用特定的、传统的研究方法,包括培养分离、电镜观察、血清学方法诊断、PCR、杂交等。这些方法都存在一定的局限性,尤其是当检测病毒或其核酸信息未知时,不利于新型病毒的发现。全面掌握蝙蝠携带病毒的本底资料,了解各种病毒的丰度信息,及时发现新发传染原,对于病毒在疾病传播过程中的作用和防治具有重要意义。作为一种有利于未知病毒发现的高效工具,病毒宏基因组学已广泛用于对各种环境介质中的病毒组学研究。蝙蝠病毒宏基因组学研究也在开展和深入进行中,目前,已有7个关于蝙蝠病毒宏基因组学的研究,一定程度上反映了蝙蝠携带病毒的多样性,提供了有价值的数据。4个来自中国境内,采用宏基因组测序探究蝙蝠体内携带病毒的研究,大部分采用各种组织的混合样品,形成预混池,提取核酸,文库构建,进行测序。一定程度上,降低了某些病毒检出阳性率,忽略了病毒存在的源组织,然而,病毒所富集的组织将进一步指导该病毒可能的传播途径。另外,逐个病毒检测工作量巨大,也受到常规检测方法敏感性的影响,且不能发现未知的病毒。本研究拟建立基于Solexa高通量测序的方法,重点关注蝙蝠肠道及粪便携带的病毒,为研究粤、琼两地蝙蝠携带病毒的提供自然本底,以进一步指导未来的蝙蝠相关病毒的分子流行病学调查和预防实践。1研究方法1.1蝙蝠标本的采集2011年7月至2014年8月,于海南海口、广东惠州、云浮及广州四个地方的蝙蝠监测点中,选取9个蝙蝠自然栖息地(居民区,城市公园,废弃的住宅和岩洞),现场捕捉蝙蝠,对捕捉蝙蝠进行编号。采集每只捕获蝙蝠的粪便,肛拭子以及剪取直肠组织标本。利用细胞色素b基因,辅之以蝙蝠研究专家进行形态学鉴定,最终确定捕捉蝙蝠种属。1.2六种常见病毒的调查研究提取520份蝙蝠粪便及直肠标本病毒RNA或DNA。对病毒RNA进行逆转录成cDNA,利用巢式PCR或普通PCR检测其携带轮状病毒、杯状病毒及细小核糖核酸病毒病毒的情况;对病毒DNA进行巢式PCR或普通PCR,检测蝙蝠标本中携带疱疹病毒,腺病毒和乳头状瘤病毒的情况。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,亮带直接送测序,如果条带较弱则进行切胶、纯化和回收,然后送样至公司测序。利用生物信息学的方法,进行同源性分析,多序列比对,构建系统进化树,计算各序列间的距离矩阵。1.3病毒宏基因组学研究按照地理位置和蝙蝠种类分为6组:***(广州犬蝠组)、***(海南长翼蝠组)、***(海南棕果蝠组)、***(惠州中蹄蝠组)、***(云浮小菊头蝠组)、***(云浮小黄蝠组)。每组选取10-15只蝙蝠进行去背景核酸处理,RNA/DNA病毒核酸提取,逆转录和单链cDNA补平形成双链dc-DNA。应用随机引物对dc-DNA进行随机扩增,对扩增产物进行检测鉴定,建库测序。对每组标本进行病毒注释和丰度分析。基于宏病毒组学高通量测序结果,对满足要求的逆转录病毒、腺病毒进行进行同源性分析,多序列比对,构建系统进化树,计算各序列间的距离矩阵。2结果2.1六种常见病毒的检测结果520份标本中,疱疹病毒、腺病毒、乳头状瘤病毒、轮状病毒检测的阳性率分别是:73%、6.9%、2.1%及0.76%。未检出细小核糖核酸病毒和杯状病毒。本研究蝙蝠疱疹病毒(HVs)分属于两种型别:β疱疹病毒属(4株)和γ疱疹病毒属(69株)。尚未在蝙蝠中发现α疱疹病毒属。以HVsDPOL基因及gB基因构建的进化树研究结果提示,本研究不同地域,不同蝙蝠种属HVs DPOL基因及gB基因具有多样性,蝙蝠HVs与其宿主具有协同进化的关系。36株蝙蝠AdVs均属于哺乳动物腺病毒属,但与其他动物(包括人)的AdVs距离较远,氨基酸相似性较低。11株蝙蝠乳头状瘤(PVs)的氨基酸相似性高,相似度为94.5%-100%,而与现有发现的其他动物及蝙蝠PVs相比,相似度较低,仅有34.5-58.9%。与其他动物相比,4株小黄蝠A组轮状病毒(RVA)与一株猴子RVA和狗RVA相似度最高,为80.2%,

关键词： 博尔纳病病毒   蝙蝠   脑组织   博尔纳病病毒p40基因片段   博尔纳病病毒核蛋白  

摘要： 目的:探讨贵州遵义地区蝙蝠体内是否存在博尔纳病病毒(BDV)的自然感染,将贵州遵义地区蝙蝠感染的BDV p40核苷酸序列与国外标准株、流行株进行同源性分析,进一步丰富贵州地区BDV流行病学特征。方法:采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Fluorescence quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,FQ-RT-PCR)对82例蝙蝠额颞叶脑组织中BDV p40基因片段进行检测,阳性产物进行纯化、克隆和核苷酸序列测定,并与国外标准株、流行株比对,分析其同源性及变异;同时采用免疫印迹法(Western blotting,WB)检测蝙蝠脑组织中博尔纳病病毒核蛋白(Nucleoprotein,N)。结果:贵州遵义地区82例蝙蝠额颞叶脑组织中,BDV p40基因片段的检出率是12.2%(10/82),通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)比对、分析阳性产物的核苷酸序列,贵州遵义地区蝙蝠脑组织中的BDV p40核苷酸序列与标准株Strain V和流行株H1766比对同源性均为96.2%,有3个碱基发生突变(nt548G>T,nt550T>G,nt553A>T),突变率为3.8%(3/78),与流行株He/80进行同源性分析时,发现有4个核苷酸发生突变(nt548G>T,nt550T>G,nt553A>T,nt609T>C),突变率为5.1%(4/78),但所编码的氨基酸并没有变化;蝙蝠额颞叶脑组织中博尔纳病病毒核蛋白阳性率为12.2%(10/82);其中有6例蝙蝠脑组织同时检出BDV p40基因片段及核蛋白。结论:贵州遵义地区的野生蝙蝠存在博尔纳病病毒的自然感染;该地区野生蝙蝠所感染的BDV p40基因片段与标准株Strain V、流行株H1766的核苷酸序列具有高度同源性,该地区可能是BDV的流行区域之一。

关键词： 东北三省   蝙蝠病毒   病毒宏基因组学分析   病毒鉴定  

摘要： 蝙蝠是世界上仅次于啮齿类动物的种类最为丰富的哺乳动物,分布在除两极的所有陆地。同时,蝙蝠又是重要的病毒储存库,能携带至少170种病毒,包括一些人兽共患病毒,如狂犬病毒、亨德拉病毒、埃博拉病毒、博卡病毒等。在我国有120种蝙蝠,分属于12个蝙蝠科30个蝙蝠属,广泛分布在我国的多个地区。东北三省包括辽宁、吉林和黑龙江,与俄罗斯和朝鲜接壤,具有重要的战略地位;该地区地域辽阔,气候独特,蝙蝠资源目前没有系统的数据,而关于我国东北地区蝙蝠携带病毒的数据更是严重缺乏,仅发现了蝙蝠伊库特病毒(Irkut virus,狂犬病毒属成员)、博卡病毒和冠状病毒,因而系统全面调查我国东北三省蝙蝠携带病毒的多样性和遗传多态性,对于了解东北地区蝙蝠病毒的本地情况具有重要的意义。本研究在2013-2014年间,于东北三省实地考察了16个市的蝙蝠生态情况,结果在6个市发现了蝙蝠,其种类主要是马铁菊头蝠、大足鼠耳蝠、白腹管鼻蝠和东方蝙蝠等,我们在这些市设置了10个蝙蝠病毒监测点,共采集了204只蝙蝠样本。通过本实验室已建立的病毒宏基因组学方法对以上样本进行病毒组分析,发现了22个科的病毒,其中注释到脊椎动物病毒有16个科20个属32个种,如白蛉热病毒、α冠状病毒和β冠状病毒、人副流感病毒4型、星状病毒以及博卡病毒等;昆虫病毒6个科,如Baculoviridae、Dicistroviridae、Iflaviridae、Parvoviridae(Ambidensovirus)、Polydnaviridae和Tetraviridaes等;还发现一个植物病毒科,Phycodnaviridae。本研究主要关注脊椎动物病毒,根据病毒宏基因组学分析结果,对星状病毒、水泡性病毒、细小病毒、小RNA病毒、环状病毒、布尼亚病毒、圆环病毒、冠状病毒等进行了鉴定分析。从辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,有病毒序列注释到了星状病毒科,在这些星状病毒序列中,与不丹国人星状病毒BtnMLB1-86同源性最高,为84%。弹状病毒科中的水疱性病毒序列发现于辽宁本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,其中水疱性病毒与美国蝙蝠水疱性病毒TFFN-2013株同源性最高,为64.3%。使用特异性PCR筛查,从辽宁省本溪市溪湖区6只马铁菊头蝠中检测到2只蝙蝠携带水泡性病毒,阳性率为33.3%;从辽宁省本溪市本溪县4只马铁菊头蝠中检测到1只蝙蝠携带水泡性病毒,阳性率为25.0%;从辽宁省本溪市恒仁县2只马铁菊头蝠中全部检测到水泡性病毒,阳性率为100%。小RNA病毒科的心病毒序列发现于吉林省的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,其中心病毒序列与刚果蝙蝠环状病毒PREDICT-06105同源性最高,为84%;并在吉林省通化市的28只大足鼠耳蝠中,检测出9只蝙蝠携带有心病毒,阳性率为33.3%。病毒宏基因组学结果中,注释到了细小病毒科博卡细小病毒属和依赖细小病毒属,在吉林省通化市的29只马铁菊头蝠中,检测出19只蝙蝠携带博卡病毒,阳性率为65.5%;在辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠、吉林省通化市的白腹管鼻蝠以及黑龙江省的东方蝙蝠中,均发现有病毒序列注释到细小病毒科依赖细小病毒属,这三株细小病毒均与我国蝙蝠腺联病毒ynm株有最高同源,分别为84%、89%以及87%,并且它们均与依赖细小病毒属病毒处在同一进化分支。注释到了呼肠孤病毒科的环状病毒的病毒序列,来源于于辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,与澳大利亚环状病毒属的eubenangeevirus具有最高同源性,为79%,并在辽宁省本溪市的29只大足鼠耳蝠中,检测出4只蝙蝠携带有环状病毒,阳性率为13.8%。。同时,这株蝙蝠环状病毒是国内首次从蝙蝠中检测到的。另外,通过特异性pcr验证,从黑龙江省的蝙蝠中,检测到了两株圆环病毒,一株是在哈尔滨市阿城区的43只东方蝙蝠中,检测出2只蝙蝠有圆环病毒基因存在,阳性率为4.7%;另外一株是在大庆市萨尔图区的9只东方蝙蝠中检测到1只蝙蝠携带圆环病毒,阳性率为11.1%。在吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中,检测出2只蝙蝠含有腮腺炎病毒属(rubulavirus)病毒基因,阳性率为5%。从吉林省通化市的29只马铁菊头蝠中,检测到有8只马铁菊头蝠携带有布尼亚病毒基因,阳性率为27.6%。对于冠状病毒的检测,一株是从吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中检测出一只蝙蝠携带α冠状病毒属的冠状病毒基因,阳性率为2.5%,另外一株是从吉林省通化市的29只马铁菊头蝠检测出一只蝙蝠携带有β冠状病毒属的冠状病毒基因,阳性率为3.5%。针对以上鉴定结果,挑取了圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒和冠状病毒进行了更进一步的研究。对两株圆环病毒进行全基因组学分析,获得了长2117nt和2113nt基因组序列。对基因组预测分析,在复制原点处,均存在茎环结构;还

关键词： 菌丝体   发酵液制剂   免疫活性  

摘要： 对蝙蝠蛾被毛孢菌丝体发酵液(HSFL)制剂进行体内和体外免疫活性研究。结果表明:该制剂在体外对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞的转化能力显著增加,并且在体外显著提高了小鼠脾脏中NK细胞的活性;在体内实验中,该制剂可以显著改善DNFB诱发的小鼠迟发型变态反应;显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。蝙蝠蛾被毛孢菌丝体发酵液制剂具有调节免疫的生物活性。