关键词：
新型冠状病毒
RBD
突变文库
抗体逃逸
摘要：
背景:
新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)流行至今,已经出现了多种变异株,与野生型病毒相比,这些突变株的传染性和抗体逃逸能力有所提高。目前主要的流行突变株Omicron对大多数中和抗体表现出不同程度的抗体逃逸,介导抗体逃逸的突变主要位于S蛋白的受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)内。RBD区域内484位点的突变最早发现于B.1.351突变株,其位点的氨基酸由谷氨酸(E)突变为了赖氨酸(K)。在此之后发现的P.1突变株中同样存在此突变。研究表明RBD区域内484位点的氨基酸突变可单独或与其他位点氨基酸协同作用提高病毒逃逸抗体中和的能力。本研究利用深度突变扫描技术,探究SARS-CoV-2在携带E484K突变的基础上,其他位点发生随机突变时对特定新冠病毒中和抗体免疫逃逸功能的影响,提前获得变异与表型改变的关系,将为中和抗体的优选、广谱免疫原的设计以及病毒传播预警奠定基础。
目的:
通过密码子突变的方式构建由酵母展示的SARS-CoV-2 RBD随机突变库,利用深度突变扫描技术,使用基于磁微粒的新冠病毒免疫逃逸筛选方法,获得针对特定新冠中和抗体的RBD区域突变或突变组合。
方法:
1.将p ETcon＿SARS＿CoV＿2-RBD质粒为模板,根据其DNA序列,首先在编码第484位氨基酸的对应DNA序列引入点突变,使其表达的氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸。将p ETcon＿SARS＿CoV＿2-RBD-E484K质粒以电转化的方式转化酵母细胞,利用外源蛋白所携带的Myc标签,与anti-c Myc的荧光抗体标记结合,用流式细胞分析技术检测RBD是否在酵母细胞表面表达。在证实RBD可在酵母细胞表面表达的基础上,通过优化诱导时间和诱导温度以提高RBD表达水平。
2.以p ETcon＿SARS＿CoV＿2-RBD-E484K质粒作为构建突变文库的初始模板,采用步移的方式设计合成覆盖在RBD每个氨基酸位点的NNS简并碱基的引物池,通过三轮PCR引入随机突变。再以第三轮突变PCR扩增后的回收产物为模板,用含有16位随机碱基序列的反向引物向每条DNA序列中引入barcode序列,将含barcode的突变片段与线性化质粒载体同源重组,转化大肠杆菌进行扩增,提取质粒。使用Pac Bio测序获得barcode与突变或突变组合之间的对应关系。
3.将突变文库质粒转化入酵母细胞,诱导RBD蛋白在酵母细胞表面表达。用磁珠分选法检测RBD蛋白突变对蛋白与抗体结合的影响。首先将展示新冠病毒RBD结构域的酵母细胞与磁珠耦联的ACE2受体蛋白孵育,磁性分离去除不能与ACE2蛋白结合能力的突变RBD。将分离得到的具备同ACE2蛋白结合能力的酵母细胞分别与磁珠耦联的58G6、55A8以及51D3三种新冠病毒中和抗体进行孵育,磁性分离逃逸中和抗体的酵母细胞,扩大培养后提取质粒进行Illumina测序确定barcode信息,再结合Pac Bio测序的结果可获得特定新冠病毒中和抗体逃逸相关的突变或突变组合。
结果:
使用快速定点突变试剂盒,在野生型RBD序列上引入E484K点突变,经测序比对,成功在p ETcon＿SARS＿CoV＿2-RBD质粒上引入该突变。将p ETcon＿SARS＿CoV＿2-RBD-E484K转化酵母细胞,流式细胞分析结果证实RBD可在酵母细胞表面表达,并通过调整诱导温度和诱导时间优化RBD表达水平。以p ETcon＿SARS＿CoV＿2-RBD-E484K为模板成功构建两个RBD突变文库,通过PCR为每种突变或突变组合添加上特有的barcode序列,Pac Bio测序获得突变文库的突变概貌并建立barcode-突变对应关系。将突变文库转化酵母细胞,用磁珠细胞分选技术分离出逃逸中和抗体结合的酵母细胞群,Illumina测序获得RBD不同突变或突变组合所携带的相应barcode序列及数目,综合分析得出不同突变介导特定抗体的逃逸分数并绘制突变-逃逸图谱,结合RBD-抗体复合物结构特征验证突变-逃逸图谱的合理性,进一步根据RBD各突变对其表达及其与ACE2结合的影响分析了介导抗体逃逸突变的适应性代价。
结论:
本研究成功构建了SARS-CoV-2 RBD的突变文库,利用深度突变扫描技术,探究了RBD各个位点的不同突变对新冠中和抗体免疫逃逸的影响,为针对SARS-CoV-2突变株的疫苗研发和抗体筛选与设计提供新的信息。
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