关键词： 新型冠状病毒   马免疫球蛋白   特异性F(ab’)2   免疫亲和层析   聚乙二醇化  

摘要： 新冠肺炎是由新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus2,SARS-CoV-2）所引起的一种以发烧、乏力、干咳等呼吸系统疾病为特征的高致病性的人兽共患病。2020年2月11日,世界卫生组织（World Health Organization,WHO）将新冠肺炎命名为COVID-19。同年3月,WHO认定其在全球呈现大流行趋势。自其发生以来,我国已有超过半数的人口感染。新冠肺炎的发生和流行对我国人口的生命安全与社会的稳定发展造成了巨大重创。虽然我国及世界其他国家相继开发出具有预防该病的相关疫苗,但由于SARS-CoV-2较快的变异能力,接种疫苗并不能完全阻止SARS-CoV-2的感染。因此,开发出有效治疗该病且安全长效的“特效药”迫在眉睫。抗体药物在预防和治疗新发传染病上具有重要作用。单抗类药物由于其所识别的抗原表位相对单一、生产周期长且生产成本高,使得落后及发展中国家无法负担其高成本。马抗血清制品成为了一种相较于单抗治疗较好的替代制剂且安全性高疗效显著,可用于免疫治疗。但人类接种马抗血清制品时常伴随着过敏现象的发生,主要是由于抗体中Fc片段中异源蛋白的免疫反应所引起的过敏反应,同时抗体纯度差和较低的特异性也会导致机体免疫系统出现强烈的排斥反应。而制备缺少Fc片段且纯度高,特异性强的免疫球蛋白F（ab’）2可避免这一现象的发生。与此同时,在临床应用中使用F（ab’）2的主要缺点是其在体内半衰期短,因此需要频繁给药来维持药效,给患者造成了经济上负担与精神上的双重压力。基于此,制备一种特异性高、中和能力强并且具有长半衰期的抗体药物是当下亟待解决的问题。本实验的主要研究如下:第1章SARS-CoV-2 RBD蛋白的原核表达与纯化从NCBI上获得SARS-CoV-2 RBD基因并通过Snap Gene软件设计其上下游的特异性引物,利用PCR技术对SARS-CoV-2 RBD基因进行扩增。扩增并鉴定正确的RBD基因与空载体p ET-30a（+）进行连接并成功构建了重组表达质粒p ET-30a（+）-RBD。随后将质粒p ET-30a（+）-RBD转入大肠杆菌进行诱导表达。并最终确定在35℃,5 h的条件下RBD蛋白的表达量最高。将表达的重组蛋白RBD采用His-Ni+柱纯化后纯度可达到95%以上。经SDS-PAGE与WB鉴定结果显示,重组蛋白RBD分子量大小为35 KDa左右,且反应原性良好,可用于免疫层析柱的制备,为后续马抗SARS-CoV-2特异性Ig G与特异性F（ab’）2的制备奠定了基础。第2章马抗SARS-CoV-2特异性Ig G与特异性F（ab’）2制备本研究首先采用Protein G亲和层析柱纯化马抗SARS-CoV-2高免血清中的总Ig G。再利用胃蛋白酶酶切的方法,将Ig G中的致敏性Fc片段切除,随后采用Protein A亲和层析柱将酶切液中的免疫球蛋白F（ab’）2与Fc分离,以期获得总免疫球蛋白F（ab’）2。将第一章所制备的免疫亲和层析柱与马抗SARS-CoV-2总Ig G与总F（ab’）2进行偶联,以期获得马抗SARS-CoV-2特异性Ig G与特异性F（ab’）2。将制备的马抗SARS-CoV-2特异性Ig G,特异性F（ab’）2分别经BCA检测浓度、SDS-PAGE检验分子量大小、薄层扫描确定纯度与假病毒中和实验检测中和活性。结果显示,所制备的马抗SARS-CoV-2特异性Ig G与特异性F（ab’）2的分子大小正确,且特异性Ig G与特异性F（ab’）2的纯度分别为91.657%和96.771%。马抗SARS-CoV-2总Ig G、总F（ab’）2、特异性Ig G、特异性F（ab’）2对假病毒均具有较好的抑制作用。在同一浓度下,特异性Ig G的中和活性显著高于总Ig G;特异性F（ab’）2的中和活性显著高于总F（ab’）2。综上,本章成功制备了高特异性高活性的马抗SARS-CoV-2特异性Ig G与特异性F（ab’）2。第3章马抗SARS-CoV-2特异性F（ab’）2的聚乙二醇化修饰采用三（2-羧乙基）膦（TCEP）将马抗SARS-CoV-2特异性F（ab’）2链间二硫键还原形成两个Fab’,随后10 KDa的MAL-PEG-MAL与被还原的Fab’进行偶联并采用阴离子交换层析进行纯化产物。产物进行BCA测浓度、SDS-PAGE鉴定分子量大小、假病毒中和实验检测中和活性并采用动物实验检测半衰期。结果显示,当MAL-PEG-MAL和还原后的特异性F（ab’）2反应后有两种产物,分别为140 KDa的Fab-PEG-Fab与70 KDa的Fab-PEG。经假病毒中和实验检测,Fab-PEG-Fab与特异性F（ab’）2对假病毒的抑制作用差异

关键词： 突发公共卫生事件   公职人员   问责  

摘要： 新冠肺炎疫情具有传播速度快、波及范围广等特点,新冠疫情防控是对人民的生命健康负责。对新冠肺炎疫情防控中失职失范的公职人员问责有助于规范公职人员行为、提高公职人员的思想觉悟、增强公职人员应对新冠肺炎疫情的能力,从而有效应对新冠肺炎疫情,保障人民的生命健康和财产安全。2003年“非典”事件中,近千名公职人员被问责。此后,我国问责制度逐步建立。新冠肺炎疫情一类突发公共卫生事件的暴发,全国各地多名公职人员被问责,虽然对新冠疫情防控起到了一定的积极作用,但是问责仍存在一些问题,例如,问责主体单一、问责程序不健全等,导致问责结果的合理性受到质疑。保障问责结果的合理性有利于激励公职人员履行职责,建设责任型政府,有效应对疫情。 本研究基于委托-代理理论、责任政府理论、多源流理论,通过查阅有关突发公共卫生事件中公职人员问责的文献,从多源流理论的问题源流、政治源流、政策源流三个维度提取突发公共卫生事件中公职人员问责结果的影响因素,并构建分析框架,运用模糊集定性比较分析方法探究各因素对于问责结果的组合作用。本研究通过收集到的330个公职人员问责案例归纳突发公共卫生事件中公职人员问责的特征,并在其中选取64个案例作为模糊集定性比较分析的数据,将问责力度作为结果变量,选取出事件严重程度、事件发生地域、政策环境、媒体和公众关注度、介入政府层级、问责职级六个条件变量,探究各因素对问责结果的影响作用。 通过研究发现,主要有四条影响问责结果的路径,其中媒体和社会关注度、政策环境是影响问责结果的核心因素,事件严重程度、事件发生地域、介入政府层级、问责职级均对问责结果具有一定的影响作用,问责职级与问责结果呈反向关系。因此,本研究从完善公职人员问责的法律体系、加强异体问责、明晰职责分配、树立正确的问责理念几方面提出问责优化建议,以提升问责结果的合理性,保障问责效果。

关键词： 突发公共卫生事件   资源动员   理性选择   动员机制  

摘要： 突发公共卫生事件具有突发性、公共性、危害性、复杂性,该事件对社会秩序具有极强的破坏力,对其应对行动则可以被视为修复甚至建立新社会秩序的过程,而且需要在限定的时间内完成以防止危害扩大化,因而在应对危机过程中的社会互动也极具复杂性。要应对突发公共卫生事件,不仅需要公共部门措施合理有效,而且需要动员社会力量才能进行遏制。综合国内外社会动员研究发现,多数社会动员研究主要以宏观视角为主,关注国家和社会的变迁,而资源动员理论虽然兴起于美国上世纪七十年代的社会运动浪潮,但是其所具有的独特视角和体系在描述社会动员上具有较为广泛的适用性,因而本文选取资源动员理论作为指导研究的主体思路。资源动员理论主要研究视角以中观和微观为主,重视在社会动员活动中动员客体参与到动员活动中的原因,以理性选择为其重要理论基础,考察作为理性人的动员客体为何参与以及如何被动员参与到社会运动中。本文关注作为动员主体的乡镇政府、社区居委会和志愿者组织如何与作为动员客体的居民进行互动。通过参与观察法和半结构式访谈法,对当地政府、事业单位、居委会人员和社区居民展开访谈,并对可编码的居民的访谈资料开展三级编码活动。通过过程——事件分析法对社区内资源动员的过程进行了描绘,阐释了突发公共卫生事件所引发的资源供需矛盾以及动员主体如何通过资源动员合理化解矛盾,并引导居民进行居家隔离以防止病毒传播。在描述事件过程的基础上,从动员主体与客体、组织架构、资源与方式这几个维度对资源动员的框架进行了理论抽象,对整个应急动员体系进行了更清晰的提炼。以资源动员为分析框架,并结合居民访谈编码资料,从共识凝聚、行动激发和动员结果这三个维度总结了资源动员的机制,可以简要总结为通过宣传凝聚共识,通过激发行动引起动员客体参与到动员活动中。具体而言,在共识凝聚层面,需要给予动员可以充分的风险信息,降低居民行动选择上的信息不对称,并且依托议题设置引导公众关注和讨论,从而凝聚关于解决危机方式的共识,避免讨论失序和动员效能减损;在此基础上,需要利用信任资本与说服手段等工具进一步凝聚关于危机解决方式的共识;在行动激发层面,需在具有解决危机方式的基础之上开展,社会自治、政府兜底、价值共建为导向分别调动组织资源、物质资源和文化资源,建构激发参与的资源运作方式。从理论层面而言,本文以实践资料丰富了动员主体高效调度资源的形式,并且突出了公共利益以及非正式网络对动员客体的激励作用,为资源动员理论中的集体动机和社会动机提供了更为丰富的阐释,对动员机制进行了更细致的探讨,并且指出未来的研究可以继续深入的方向。从实践层面而言,本文是对该地应急资源动员成功经验的总结,所揭示的动员机制具有相应适用性,以动员客体的行动选择为观察角度的方法能够为实践提供重要参考,与以人为本的理念具有一致性,但是也强调了该经验是基于该地自身资源禀赋,经验迁移需要因地制宜地进行资源动员活动安排,充分考虑和尊重动员客体的行动选择,达成社会协同治理的理想状态。

关键词： 新型冠状病毒肺炎   新型冠状病毒   亚单位疫苗  

摘要： 亚单位疫苗具有安全性高、稳定性好、有效性强、运输要求低等特点，成为新型冠状病毒肺炎疫苗研发的较佳选择，也是具有提高疫苗接种覆盖率潜力的疫苗类型。本文从专利技术角度和上市许可进程方面对目前具有一定代表性的基于全长刺突糖蛋白或其受体结合结构域的亚单位疫苗技术进行了综述，并总结了相关主要研发策略或改进方式，以期对新型冠状病毒肺炎亚单位疫苗的研制、生产和接种提供借鉴。

摘要： 辛伐他汀主要用于降血脂和心脏保护, 同时具有抗炎和免疫调节作用。但辛伐他汀对新型冠状病毒(新冠病毒)感染危重症患者的疗效尚不清楚。近期由多国学者共同进行了一项随机、嵌入式、多因素适应性平台试验(REMAP-CAP), 旨在明确辛伐他汀治疗对基线时未接受他汀类药物的新冠病毒感染危重症患者的病死率及器官支持的影响。该研究将新冠病毒感染的危重症患者随机分为辛伐他汀组(基线时未接受他汀类药物, 给予辛伐他汀80 mg/d治疗)与对照组(不使用他汀类药物)。主要结局为呼吸和心血管器官无支持天数, 结合院内死亡和幸存者至第21天无器官支持天数的顺序量表进行评估;使用贝叶斯分层序数模型分析。自适应设计包括预先指定的统计停止标准, 以确定优越性〔优势比(OR)>1的后验概率>99%〕和无效性(OR<1.2的后验概率>95%)。结果显示, 该研究于2020年10月28日开始, 随着新冠病毒感染病例的减少, 于2023年1月8日结束。最终纳入了2 684例重症患者。辛伐他汀组无器官支持天数为11(-1, 17)d, 对照组为7(-1, 16)d;与对照组比较, 辛伐他汀的后验中位校正OR=1.15, 95%可信区间(95%CI)为0.98～1.34, 产生95.9%的后验优势概率。90 d时, 生存风险比(HR)=1.12, 95%CI为0.95～1.32, 辛伐他汀疗效优越的后验概率为91.9%。二次分析结果与初步分析结果一致。辛伐他汀组与对照组相比, 出现更多的严重不良事件报告如肝酶和肌酸激酶水平升高。研究人员据此得出结论:尽管因病例减少而停止试验, 但在新冠病毒感染的危重病患者中, 辛伐他汀未达到优于对照组的预定标准。

关键词： 新型冠状病毒   胶体金   双抗体夹心   侧向免疫层析  

摘要： 自2019年新型冠状病毒爆发以来,疫情给全球人类造成极大冲击。随着科研人员的不懈努力,新冠病毒临床检测方法多种多样,各有所长。由于新冠病毒传播速度极快、容易造成聚集性扩散,但致病性降低,由此国家制定了疫情全面放开政策,鼓励居家自检自测,胶体金免疫层析抗原自测方法及试剂符合国家政策与社会需求。本文以市售新型冠状病毒高度保守核衣壳N蛋白抗体为原料,基于双抗体夹心检测原理,以胶体金作为示踪标志物标记检测抗体,构建胶体金免疫层析检测方法,对原材料及检测体系进行优化,制备了新冠病毒抗原自测封闭式、可视化、侧向免疫层析试剂条,研究了该方法灵敏度与特异性,最后实现了新冠病毒阳性样本的应用检测。通过对不同尺寸粒径胶体金抗体标记、不同来源3对检测线N蛋白抗体配对、4对质控线抗体配对以及NC膜等原材料进行反应体系优化研究,制备了封闭式检测试剂条,对重组N蛋白最低检测限达到5 pg/m L,同时对腺病毒、呼吸道合胞病毒、金黄色葡萄球菌等病原体灭活液进行交叉反应研究,结果表明对其他病原体无交叉反应。对101例样本进行核酸和抗原检测,其中包括56例新冠病毒核酸阳性样本,45例核酸阴性样本,核酸与抗原检测结果进行对比,阳性符合率为96.43%,阴性符合率为100%,总符合率达到98.02%。本试剂条经过重组N蛋白及新冠病毒样本的验证,能够满足快速、准确、现场检测和居家自测的需求,具有良好的灵敏度及特异性,符合率高于同类产品主要性能指标,并且在检测限及生物安全方面具有一定优势。作为新冠病毒感染重要检测手段,该方法能有效地解决核酸检测依赖仪器设备,检测时间长的问题,满足临床诊断应用的需求,具有广泛的适用性,对于积极响应国家新冠疫情有序放开政策、防控疫情快速传播具有重要意义。

关键词： SARS-CoV-2   Omicron变异株   中和抗体   假病毒   中和活性   免疫逃逸   抗体组合  

摘要： 研究背景由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronaviru s 2,SARS-CoV-2)感染引起的全球新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease,COVID-19)的大流行,导致了严重的公共卫生负担和社会经济危机。中和抗体已被证明对治疗轻度和中度COVID-19患者非常有效。然而,由病毒快速突变产生的一系列O micron亚型株逃逸了大多数商业化的治疗性抗体。面对不断变异的新冠病毒以及单一抗新冠病毒中和抗体面临的耐药威胁,筛选或设计靶向SARS-CoV-2高保守位点的广谱中和抗体以及抗体的组合可能是解决病毒变异株免疫逃逸的有效措施。迄今为止,还没有一种鸡尾酒抗体或广谱抗体被证明对突变介导的抗体逃逸完全免疫。综合考虑,开发靶向不同表位的抗体组合可以为COVID-19提供额外的治疗选择。前期实验研究中我们利用B细胞培养结合抗体克隆技术,从SARS-CoV-2感染康复患者外周血中筛选出一系列靶向新冠病毒不同表位的特异性抗体。抗体依据与病毒S糖蛋白结合分为NTD、RBD和S2特异性抗体。本研究拟探讨特异性抗体对Omicron的中和活性以及对其关键突变位点的结合能力,以筛选出有效中和不同变异株的抗体组合。第一部分Omicron变异株关键突变位点对人源中和抗体识别的影响研究内容及目的:采用定点突变的方法构建了含有Omicron关键突变位点的S1质粒,利用捕获ELISA法分析抗体825、843、809、826和846与突变位点S1蛋白的结合能力,明确关键突变位点对抗体识别的影响,预测对5株抗体产生逃逸的突变位点可能有哪些。研究方法:1.关键突变位点质粒的构建及表达:设计好含关键突变位点的引物,经PCR扩增含有突变位点的目的序列,转化目的序列到DH5α感受态细胞,挑克隆送测序,测序结果与模板质粒序列经SnapGene 比较,如为目的突变位点序列,扩大生产质粒,经转染到HEK293T细胞中进行突变位点蛋白的表达。2.捕获ELISA方法:用鼠抗包被ELISA板,可捕获表达成功的突变位点S1蛋白抗原,加入筛选出来的中和抗体,再加入带有HRP标记的羊抗人IgG(H+L),在底物TMB催化下显色。分析抗体与含Omicron关键突变位点S1蛋白抗原的结合情况。研究结果:1.一系列关键突变位点的选择依据大量文献报道,本实验总结了一些造成已获批准的COVID-19治疗性抗体逃逸的关键突变位点 T19I,del 24-26,A27S,G142D,del 143-145,S371L,S371F,S373P,S375F,D405N,K417N,N440K,G446S,E484A,Q493R,G496S,Q498R,N501Y,Q493R+G496S,Q493R+Q498R。2.关键突变位点质粒的构建与表达应用SnapGene软件将生工生物公司反馈的测序结果与模板序列进行比对分析,结果表明,利用点突变方法成功构建了含20处关键突变位点的质粒。将上述构建的部分关键突变位点质粒转染HEK293T细胞进行表达,经Western Blot分析表达鉴定,所有关键突变位点蛋白成功表达,条带大小正确。3.关键突变位点抗原稀释度的选择为接下来的ELISA实验做准备,避免所用抗原过度饱和,提高实验的灵敏性,本研究对表达的关键突变位点抗原进行梯度稀释,用特异性抗体对抗原进行了定量,选择相应的抗原稀释度。4.含Omicron关键突变位点的S1蛋白对抗体结合能力的影响809、826和843对带有单点突变S371F、S375F和G446S的S1蛋白的结合能力降低,S371F和S375F降低了 809、826、825和843对S1蛋白的结合能力。T19I、S371F和del143-145降低了 NTD区域单抗846对S1蛋白的结合能力,RBD区域的突变位点对846抗体基本不会产生影响。综上,抗体809、826、825、843对NTD区域的关键突变位点有较好的结合能力,结合能力减弱主要集中在S371F、S375F和G446S位置;846对带有突变的T19I、del143-145和S371F蛋白结合能力降低。结论:5株抗体对大部分Omicron关键突变位点有较好的结合能力。S371F、S375F和G446S 降低了抗体 809、826、825、843 的结合能力,T19I、del143-145 和 S371F 降低了 846抗体的结合能力,预示这些位点的突变有可能使5株抗体对Omicron变异株的中和作用降低或产生逃逸。第二部分基于流式细胞技术SARS-CoV-2假病毒中和实验方法的建立及人源中和抗体对Omicron变异株中和活性的评估研究内容及目的:建立SARS-CoV-2假病毒中和系统,并探讨已获得针对SAR

关键词： 新型冠状病毒感染   孕妇   围产   围产儿   结局  

摘要： 目的 通过对比分析围产期新型冠状病毒（Severe acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS‐CoV‐2）感染孕妇与未感染孕妇的临床资料差异,探究围产期SARS‐CoV‐2感染对孕妇分娩结局及围产儿结局的影响,并为孕产妇患新型冠状病毒感染（Coronavirus Disease 2019,COVID‐19）的诊疗策略提供参考。 方法 收集电子病历系统、检验及影像报告系统内2022年11月1日至2023年1月31日于深圳市第二人民医院产科住院分娩的SARS‐CoV‐2感染与未感染的孕妇的临床资料并进行筛选,最终纳入516例研究对象,其中SARS‐CoV‐2感染孕妇（病例组）311例,未感染孕妇（对照组）205例。所收集的临床资料包括研究对象的人口学特征资料、临床症状、实验室及影像学检查结果、孕期治疗措施以及孕妇的分娩结局及新生儿结局等数据。采用SPSS 26.0软件对所收集的数据进行统计学处理,符合正态分布及近似正态分布的计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示,两组间比较采用独立样本t检验;偏态分布计量资料以M(P25,P75)表示,采用Wilcoxon秩和检验进行两组间比较;计数资料以N%表示,组间比较采用卡方检验,理论值小于1时使用Fisher确切概率法,P<0.05时有统计学差异。按照确诊COVID-19距离分娩的时间≤14天和>14天将病例组进行亚分组,采用多样本Kruskal Wallis秩和检验分析≤14天组、>14天组与对照组的检验检查结果的差异,两两比较时采用Bonferroni法,P<0.05时认为差异具有统计学意义;采用卡方检验及Cramer’s V系数评估确诊COVID-19距离分娩的时间与病例组孕妇分娩方式、胎膜早破、胎儿窘迫、羊水污染情况等的相关性,两两比较时采用Bonferroni法,P<0.05时认为差异具有统计学意义,Cramer’s V系数的取值范围在0到1之间,数值越大则相关性越强。 结果 1.病例组中大多数（97.4%）孕妇为轻型感染,主要症状为发热（86.5%）与咳嗽（74.3%）。2.病例组分娩孕周早于对照组,剖宫产率、胎儿窘迫、羊水污染比例较对照组更高, 差异有统计学意义（P<0.05）,其中分娩距离发病≤14天的孕妇胎儿窘迫的发生率 升高（P<0.05）。两组的早产率、产后出血率无明显统计学差异（P>0.05）。 3.病例组及对照组孕妇分娩的新生儿的出生体重、窒息率、转科情况及肺炎发生率无 明显差异。 4.病例组孕妇的血红蛋白、淋巴细胞、降钙素原水平以及凝血酶原时间（Prothrombin time,PT）降低,超敏C反应蛋白、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、 门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）均升高,与对照组相比具有 统计学差异（P<0.05）。 5.分娩距离发病14天内的孕妇的淋巴细胞、PT明显下降,超敏C反应蛋白、ALT、 AST均升高（P<0.05）,而分娩距离发病14天以上的孕妇血红蛋白明显下降（P< 0.05）。 研究结论 1.围产期孕妇患COVID-19的主要表现与非妊娠妇女相似,以非特异的上呼吸道感染 症状为主,大多数患者属于轻症感染。 ***-19对孕妇的感染指标、凝血功能、肝酶指标等的影响多为一过性,对血红 蛋白的影响则多出现在急性期后,可加重感染孕妇的贫血情况。 ***-19及其引起的急性期症状会增加孕妇的剖宫产率以及胎儿窘迫、羊水污染 等不良妊娠结局的发生率。 4.尚未发现孕妇患COVID-19导致新生儿不良结局发生率上升的证据。

关键词： 电致化学发光   聚合物   生物传感器   SARS-CoV-2   microRNA-21  

摘要： 电致化学发光（ECL）结合了电化学及化学发光技术的优点,具有高的灵敏度、低的背景信号以及宽的检测范围,已广泛应用于生物分析领域。对于ECL体系而言,发光体扮演着重要的角色。提高发光体的ECL强度是提高ECL检测灵敏度的关键。聚合物具有光稳定性好、易功能化和生物相容性好等优点,在ECL生物传感领域得到了关注,但其ECL效率通常不够高。通过共反应试剂的富集、共反应试剂介导及共振能量转移等策略可有效增强发光体的ECL信号,也为改善聚合物的ECL效率提供了思路。此外,近红外（NIR）发射的ECL发光体在生物传感和成像中引起了研究者们的兴趣,在ECL领域开发新型的NIR聚合物纳米材料是十分有意义的。由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎对人类的身体健康造成了很大的危害。SARS-CoV-2核衣壳蛋白（ncov NP）因其蛋白含量丰富,已被认为是新冠肺炎的诊断标志物之一。SARS-CoV-2 Rd RP基因具有高的特异性,可以有效区分SARS-CoV-2和SARS-CoV,也常被作为新冠肺炎诊断的标志物。因此,实现对SARS-CoV-2的ncov NP和Rd RP基因的灵敏检测对于新冠肺炎的诊断及其治疗具有重要意义。Micro RNA-21是多种肿瘤的生物标志物,其含量变化可反映出肿瘤的分化状态。Micro RNA-21的灵敏检测对于维护人体的健康也具有重要价值。在应用于ncov NP、SARS-CoV-2 Rd RP基因及micro RNA-21分析的各种技术中,ECL传感技术因其高灵敏和简单操作等优势已展现出巨大应用潜力。本论文探索了应用共反应试剂富集及共反应试剂介导增强策略以改善聚合物纳米材料的ECL效率,同时,利用聚合物与染料之间的能量转移以制备获得NIR发射的ECL发光体,进而构建了基于单信号及双信号比率策略的三种生物传感器,实现对ncov NP、SARS-CoV-2 Rd RP基因及micro RNA-21的灵敏检测。主要工作如下:（1）局部疏水富集共反应试剂以增强共轭聚合物的ECL用于ncov NP检测共反应试剂的富集是提高ECL检测灵敏度的关键之一。本工作提出利用β-环糊精（β-CD）的内部疏水空腔局部疏水富集共反应试剂而增强ECL信号的策略。在β-CD金属离子的配位位点上原位生长Pt纳米粒子（Pt NPs）以制备β-CD-Pt纳米复合材料,该复合材料不仅可通过其疏水腔高效富集共反应试剂3-（二丁氨基）丙胺（TDBA）,还能通过Pt-N键固定TDBA,以显著增强羧基功能化的聚[2,5-二辛基-1,4-亚苯基]（PDP）纳米粒子（PNPs）的ECL强度。ECL发光体PDP PNPs耦合TDBA-β-CD-Pt纳米复合材料构建生物传感器,实现SARS-CoV-2核衣壳蛋白（ncov NP）的高灵敏检测。PDP PNPs被首先修饰到玻碳电极表面,然后依次捕获一抗（Ab1）、抗原和二抗复合物（TDBA-β-CD-Pt@Ab2）,构建夹心免疫生物传感器,对ncov NP的检测限低至22 fg/m L。TDBA-β-CD-Pt纳米复合材料为局部疏水富集共反应试剂以提高ECL检测灵敏度提供了新思路。发光体PDP PNPs与TDBA-β-CD-Pt纳米复合材料的结合,开辟了一个有前景且灵敏的ECL平台,为ncov NP检测提供了新方法。（2）过硫酸根介导的双ECL发射共轭聚合物用于SARS-CoV-2 Rd RP基因的比率分析聚合物因其优异的ECL特性而引起人们的广泛关注。但目前聚合物的研究和应用主要集中于阳极发射,且ECL效率不够高,应用范围有限。本工作利用过硫酸根(S2O82-)介导聚[2,5-二辛基-1,4-亚苯基]聚合物纳米颗粒（PDP PNPs）的双ECL发射。以S2O82-和3-（二丁氨基）丙胺（TDBA）分别为阴极和阳极共反应试剂,在单一扫描过程中,PDP PNPs表现出优良的双ECL发射特性,阴极和阳极ECL电位分别在-2.0 V和+1.0 V。有趣的是,S2O82-可以同时介导双发射,即显著增强阴极和阳极发射。探索了双ECL机制,并根据实验结果推测了阴极共反应试剂S2O82-增强阳极发射的机理为:S2O82-在阴极电位扫描过程中产生具有强氧化性的SO4?-自由基,其可氧化PDP PNPs产生更多的发光体阳离子自由基,从而增强PDP PNPs的阳极发射。此外,利用黑洞猝灭剂-2（BHQ2）作为双功能调控因子,同步猝灭PDP PNPs的双发射。PDP PNPs结合BHQ2以构建ECL比率传感器,对SARS-CoV-2Rd Rp基因的检出限为25.1 a M。过硫酸根介导的双发射为提高聚合物ECL发光效率和扩大其ECL应用提供了新途径。双发射的PDP PNPs与双调控因子BHQ2的巧妙结合创建了一有前景的基于单发

关键词： 死亡   危险因素   预测价值   新型冠状病毒肺炎  

摘要： 背景新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-Co V-2)感染导致的病毒性肺炎,根据病情严重程度COVID-19主要分为四型:轻型新冠肺炎、普通型新冠肺炎、重型新冠肺炎及危重型新冠肺炎。重型和危重型患者有快速发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的可能,常常导致组织缺氧,出现高乳酸血症,继发多器官衰竭(MOF),并最终导致死亡。疫情初期,因感染人数众多、医疗资源短缺等多种因素导致救治效率较低,部分患者常因救治不及时病情进展快,甚至突发死亡。病情的急剧变化导致部分患者还未及时采取机械通气等进一步治疗便已死亡。因此,了解COVID-19患者的死亡危险因素,于疾病初期识别出潜在的死亡患者并积极给予关注,对提高患者的生存率至关重要。目的分析新型冠状病毒肺炎患者死亡的危险因素,应用多因素非条件Logistic统计和ROC曲线法构建COVID-19死亡预测模型。方法回顾性分析2020年2月4日-3月30日武汉火神山医院收治的2321例COVID-19患者临床资料,通过查阅电子病历,收集患者的临床资料特征指标共75项,根据单因素统计分析、文献资料及临床经验筛选有意义的指标,然后利用多因素非条件Logistic回归法去寻找这些有意义的指标中的COVID-19患者死亡的独立危险因素。最后根据分析结果构建新冠肺炎死亡预测模型;绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析该新冠肺炎死亡预测模型的预测价值。结果本研究共收集确诊COVID-19患者2321例,其中死亡病例55例(2.4%),年龄(70.69±11.67)岁,非死亡病例型2266例(97.6%),年龄(58.78±14.38)岁。与非死亡患者相比,死亡患者年龄更大(70.69±11.67岁比58.78±14.38岁),伴有发热、咳嗽、呼吸困难、纳差、冠心病、高血压、糖尿病、慢性支气管炎、慢阻肺、脑血管病、呼吸衰竭、胸腔积液、气胸等(共51项)的患者更多,差异均有统计学意义(P<0.05)。根据统计分析结果、相关文献报道和临床经验筛选出包含患者的年龄、临床症状、基础疾病、辅助检查、生命体征及并发症共23项指标纳入多因素非条件Logistic回归分析,结果显示,呼吸困难(OR=2.038,95%CI为1.288-3.223)、合并冠心病(OR=1.969,95%CI为1.184-3.276)、高水平BUN(OR=2.097,95%CI为1.331-3.304)、高水平CRP(OR=1.957,95%CI为1.122-3.414)、高水平LDH(OR=1.841,95%CI为1.409-2.407)、高收缩压(OR=2.902,95%CI为1.065-7.907)、并发呼吸衰竭(OR=1.669,95%CI为1.373-2.027)是新型冠状病毒肺炎患者入院后出现死亡结局的独立危险因素。以上述独立危险因素建立新冠肺炎患者的死亡预测模型,并进行ROC曲线分析显示,预测COVID-19患者死亡的AUC为0.987,最佳阈值为-3.701时的特异度为0.944、敏感度为0.982。排除并发症行分类统计时,COVID-19患者的临床症状积分、辅助检查积分、生命体征积分是患者死亡的独立危险因素。据此构建死亡预测模型,并进行ROC曲线分析显示,预测COVID-19患者死亡的AUC为0.976,最佳阈值为-4.303时的特异度为0.919、敏感度为0.982。结论新冠肺炎患者的死亡结局与临床症状、辅助检查指标、生命体征等多种因素有关;本研究对预测COVID-19患者死亡具有一定价值,可作为快速预测COVID-19患者病情变化并进行早期干预的参考。