关键词:
SARS-CoV-2
B细胞克隆技术
中和抗体
摘要:
自2019年以来,由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(新冠病毒,Sever acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)导致的新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎,coronavirus disease 2019,COVID-19),在全球范围内造成严重的感染和大量的死亡病例,对全球卫生系统和人类健康造成破坏。SARS-CoV-2在广泛传播过程中产生多种谱系突变株,不同突变株其感染能力、病毒载量、致病性均有所改变。已有突变株表现出对部分自然感染和接种疫苗后诱导的中和抗体产生免疫逃逸,为疾病预防和临床治疗带来巨大挑战。因此,快速筛选和鉴定出新冠病毒全人源广谱中和抗体,能够为新冠病毒感染后的治疗提供有效策略。本研究利用新冠肺炎康复者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),通过磁珠分选结合流式分选技术,获得抗原特异性记忆B细胞;继续运用单B细胞克隆技术,在体外克隆表达重组全人源抗体;通过酶联免疫检测(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和假病毒微量中和实验鉴定抗体的结合及中和能力,最终鉴定出多株靶向新冠病毒刺突蛋白(Spike,S)的单克隆抗体。首先,本研究建立了磁珠分选结合流式分选技术。通过Pan B磁珠分选提高了样品中记忆B细胞比例,从1.36%提高至7.36%,提升了后续流式分选效率。比较使用该方案处理新鲜样本和冻存样本后的差异,本方案能够有效去除死细胞,使复苏后的冻存样本中细胞活率由80%提升至95%,抗原特异性记忆B细胞比例在两种样本类型中无明显差异。其次,本研究优化了抗体基因表达载体构建流程,通过重叠延伸PCR将抗体基因直接扩增构建至表达载体中,提高了载体构建的效率。单B细胞PCR结果显示,扩增抗体基因的效率超过90%。通过比对表达载体的测序结果,本研究共获得174株重组抗体序列。本研究利用HEK293F悬浮培养系统重组表达了 174株全人源抗体,通过ELISA结合实验筛选,鉴定出33株靶向Spike蛋白的抗体,并进一步确定了其中有15株为结合NTD的抗体、19株为结合RBD的抗体、28株为结合S1的抗体和8株为结合S2的抗体。多反应性结合实验结果显示,结合S2的抗体均能交叉识别SARS-CoV-2 和 SARS-CoV,部分 RBD 抗体能够交叉结合 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV,后续鉴定证实其为结合Class 3区域的抗体。研究发现JYTA108和JYTA172结合RBD Class 1和Class 2区域,具有广谱中和活性,能够中和包括原型株、Alpha、Gamma、lota、Epsilon、Delta、Lambda、BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75及BA.4/5株在内的假病毒毒株,但其对Omicron及其亚系突变株的中和活性有所下降;JYTA034结合RBD Class 3区域,具有广谱结合活性,能够结合原型株、Beta、Delta、C.1、BA.1及XBB突变株的RBD蛋白,其中和活性在检测的突变株中无明显差异。为进一步提高抗体检测及筛选通量,本研究利用均相时间分辨荧光技术(Homogeneous Time Resolved Fluorescence,HTRF)构建了 高通量 RBD 特异性抗体检测体系:使用2.5 μL 40 nM RBD蛋白即可检测抗体浓度,可测得的抗体浓度范围为 0.003 μg/mL-40.8 μg/mL。综上,本研究优化了单B细胞PCR克隆抗体的流程,建立了 HTRF高通量筛选RBD抗体技术,完善了新发突发病原体全人源抗体筛选平台。利用新冠肺炎康复者PBMC样本成功分离鉴定了多株针对S蛋白的单克隆抗体,初步阐明了作用位点和机制,为潜在的治疗方法提供数据参考和理论依据。