关键词:
新型冠状病毒
甲型流感病
DNA疫苗
双价疫苗
棘突蛋白S1
血凝素
摘要:
目的:评价不同SARS-CoV-2 VOC及IAV的双价DNA疫苗的免疫原性及保护效果,评价不同的二联四价DNA疫苗配伍方案的免疫原性及保护性。方法:1.基于SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株及IAV H1N1/Victoria/2019双价DNA疫苗的构建及效果评价:基于科室之前的新型冠状病毒及甲型流感病毒双价DNA疫苗的结构pVRCBS1-2A-HA3,我们选择了当下流行的Omicron BA.1变异株的S1抗原作为靶蛋白,在S1末端加入了T4motif三聚体基序,将原始结构中的Beta变异株的S1序列予以替换。同时根据WHO最新推荐的2021~2022年北半球流感疫苗组分,将疫苗结构中HA抗原由H3N2/Cambodia/e0816360来源替换为H1N1/Victoria/2019的HA抗原。将设计好的片段进行深度人源优化,合成后插入pVRC质粒载体中并命名为pVRC-OS1T-2A-HA1。使用WB及间接免疫荧光法验证DNA疫苗在293T细胞中的表达情况。表达成功后使用DH5α大肠杆菌对DNA疫苗进行扩增,瞬时转染进入293T细胞后评估其S1及HA的蛋白表达。选择BALB/c小鼠作为动物研究模型进行DNA疫苗的免疫,注射方法为肌肉注射+电转导(IM+EP),每次30μg,按照Prime+Boost免疫方案进行DNA疫苗免疫。我们通过ELISA、血凝抑制实验及假病毒中和实验检测初次免疫后2周(Day14)、加强免疫后2周(Day35)及攻毒前(Day69)的体液免疫应答,使用ELISPOT法分别检测武汉原始株S蛋白敏感肽池及Omicron变异株S蛋白敏感肽池的特异性IFN-γ分泌,评估不同肽池在不同时间的特异性细胞免疫应答情况。在Day69分别经鼻进行新型冠状病毒及甲型流感病毒的攻毒实验来评价疫苗的保护效果。在攻毒后第3天处死小鼠并取肺组织,使用MDCK细胞滴定小鼠肺组织流感病毒载量,使用Vero细胞滴定小鼠肺组织新型冠状病毒载量。并通过肺组织切片及H&E染色评估肺组织病变情况。2.基于SARS-CoV-2 VOC及甲型流感双价DNA疫苗不同结构的构建与二联四价疫苗的效果评价:在pVRC-OS1T-2A-HA1攻毒效果良好的情况下,我们进一步对双价DNA疫苗的结构进行探索,将S1及HA位置进行前后调换,同时将S1替换为新冠Delta变异株S1结构,与H3N2/Cambodia/e0816360及H1N1/Victoria/2019分别组合形成两个新的DNA片段,深度人源序列优化后分别合成并插入pVRC DNA载体中命名为pVRC-HA1-2A-DS1T,pVRC-HA3-2A-DS1T。将四种DNA结构进行分组a:pVRC-BS1-2A-HA1,b:pVRC-OS1T-2A-HA1,c:pVRC-HA1-2A-DS1T,d:pVRC-HA3-2A-DS1T。使用WB及间接免疫荧光验证DNA在293T细胞水平的表达;验证完成后按照以下配伍方案进行1:1等比例(15μg+15μg)混合得到a+b、a+c、b+d三个不同免疫组,同时Mock组30μg进行免疫实验,免疫策略使用IM+EP及Prime+Boost方法。分别于初次免疫后的2周(Day14)及加强免疫后的2周(Day35)使用间接ELISA法检测Ig G抗体滴度,血凝抑制实验评价血凝抑制抗体滴度,使用ELISPOT评价Day14及Day35的细胞免疫应答。加强免疫后的3周(Day42)进行甲型流感病毒H1N1 PR8攻毒实验。于攻毒后第7天处死部分小鼠,评价肺组织病毒RNAcopies、病毒滴度及肺组织病理,并持续监测14天剩余各组小鼠体重及生存率的变化。在Day70时进行新型冠状病毒的攻毒实验,攻毒后第三天处死小鼠,检测肺组织病毒滴度、RNAcopies及通过H&E染色评价肺组织病理变化。3.结果:1.基于SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株及IAV H1N1/Victoria/2019双价DNA疫苗pVRC-OS1T-2A-HA1通过WB及间接免疫荧光在293T细胞中表达良好2A自剪切肽作用,使得HA及S1能独立表达。通过加强免疫,可诱导BALB/c小鼠模型表现出良好的免疫应答,其假病毒中和抗体能针对WT、Delta、Beta及Omicron等新冠变异株产生一定交叉中和作用。血凝抑制抗体滴度在Day35可达1:49,在Day69可稳定于1:45。针对新冠Omicron BA.2变异株的攻毒起到了一定的保护作用,针对甲型流感病毒H1N1 PR8鼠肺适应株的攻毒也具有保护作用。2.基于pVRC-BS1-2A-HA3及pVRC-OS1T-2A-HA1两个DNA结构进一步更换S1及HA的前后位置,同时替换S1为Delta变异株的S1,得