关键词:
化学发光
阵列传感器
过氧化物酶
纳米酶
氧化铜
新冠肺炎
摘要:
当前癌症仍是难以治愈的疾病,2019年爆发的新冠肺炎也对人们的生产生活造成了严重打击和影响,针对目前大规模癌症和新冠肺炎的筛查及临床诊断要求,本文构建了基于纳米酶的灵敏无标记化学发光成像免疫传感器,以快速灵敏检测肿瘤标志物和新冠病毒蛋白及其抗体。传统的化学发光成像免疫传感器,通常以易失活、难提取且稳定性不佳的天然酶(如辣根过氧化物酶)催化过氧化氢产生过氧自由基触发鲁米诺发光过程。相较于天然酶,纳米酶具备成本低廉、制作简单、性质稳定、催化活性可控等优势。在非贵金属中,铜产量大、成本效益高。此外,金属组分多重氧化态可以为氧化还原反应提供有趣的催化特性,十分适合制备过氧化物酶。氧化铜是著名的p型半导体材料,由于其能带低、催化活性高、无毒且价格合理,已被广泛用于各类传感器中。但是,氧化铜纳米酶在化学发光免疫传感器领域还鲜有报道。为此,本文合成了 CuO空心立方体、Au/CuO纳米棒和缺陷ZIF-67@CuO三种纳米酶。所制备的纳米酶具有优异的过氧化物酶活性,以壳聚糖-纳米酶作为基底,构建了无标记化学发光成像免疫传感器,从而实现了多种生物标志物的低成本、快速灵敏和同时检测。具体研究工作如下:(1)针对肝癌临床诊断过程中需要联合检测多种标志物以提高诊断的准确性,本研究开发了基于CuO空心立方体纳米酶的无标记化学发光免疫传感器。通过多元醇还原法和氨水-空气氧化刻蚀制备了氧化铜空心立方体。利用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、紫外可见吸收光谱(UV-vis)、X射线衍射(XRD)等手段对所制备材料的形貌、组成以及类酶活性进行了表征。该纳米材料呈空心立方体,具有出色的过氧化物酶性能和优秀的动力学特征,可增强并延长氧化鲁米诺的发光。通过壳聚糖将纳米酶包埋在免疫传感器微孔中,利用壳聚糖丰富的官能团连接固定肝癌标志物(AFP、CEA)抗体。当样品中存在目标抗原时,形成免疫复合物阻碍纳米酶对底物的催化作用,使化学发光信号减弱,从而实现对目标分析物的检测。结合配套软件分析,即可实现肝癌肿瘤标志物的定量检测。构建的基于CuO的免疫传感器检测范围在0.1-100 ng/mL(AFP)和 0.1-200 ng/mL(CEA),AFP 和 CEA 的检测限均为 0.01 ng/mL。此外,所制备的免疫传感器显示出良好的特异性和稳定性,有重要的实际运用价值。(2)针对当前新冠肺炎的居家诊断,本研究开发了一种基于Au/CuO纳米棒纳米酶的化学发光成像免疫传感器。通过室温下硼氢化钠的还原氯金酸,氯金酸氧化氢氧化铜制备了 Au/CuO纳米棒。利用SEM、TEM、UV-vis、XRD和X射线光电子能谱技术(XPS)等手段对所制备材料的形貌、组成以及类酶活性进行了表征。该纳米材料呈棒状,具有优良的类过氧化物酶性能。通过壳聚糖的成膜性,将棒状Au/CuO纳米酶包埋于免疫芯片微孔中。壳聚糖表面有丰富的官能团,生物相容性好,用于连接新冠病毒表面刺突蛋白的一段多肽P4,成功构建了新冠抗体检测免疫传感器。当样品中存在目标抗体时,形成免疫复合物阻碍底物与纳米酶的接触,使化学发光强度降低,实现对新冠病毒的高灵敏检测。基于Au/CuO纳米酶的免疫传感器检测范围在0.0001-50 ng/mL,检测限为0.03 pg/mL。此外,所制备的免疫传感器显示出良好的特异性和重复性,有良好的应用前景。(3)沸石咪唑骨架(ZIF-67)已经被证明是一种有效的催化剂,其高密度的金属活性位点分散确保了足够的催化中心,多孔结构使所有活性位点都易于使用,并且开放的通道促进了相关的质量传递和扩散。本工作开发了一种基于缺陷ZIF-67@CuO纳米酶的化学发光成像免疫传感器。首先合成海胆状的氧化铜,用聚乙烯吡咯烷酮修饰后,采用种子介导法在常温下生长ZIF-67,最后用多金属氧酸盐刻蚀ZIF-67,使之暴露CuO和更多活性位点。通过TEM、UV-vis、XRD和XPS等手段对所制备材料的形貌、组成以及类酶活性进行了表征。所制备的复合材料具有出色的似过氧化物酶活性,兼具ZIF-67和CuO的催化动力学特性,可缩短化学发光强度检测时间。当存在目标分析物时,形成免疫复合物阻碍底物与纳米酶的接触,目标抗原/抗体浓度越高,化学发光强度越低。基于缺陷ZIF-67@CuO纳米酶的化学发光成像免疫传感器检测范围在0.01 pg/mL-200ng/mL(P4)、0.01 pg/mL-100ng/mL(G5),检测限均为 0.003 pg/mL。所制备的免疫传感器显示出良好的特异性和重复性,为新冠病毒的诊断提供了一种新型策略。