关键词:
新冠肺炎
严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型-核衣壳蛋白
表面增强拉曼光谱
侧向流动分析
二维基底
羧基化磁性纳米粒子
摘要:
新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19),简称“新冠肺炎”,是一种由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引发的传染病,导致了一场持续三年的全球疫情,也成为人类历史上致死率最高的流行病之一。对疑似病例进行快速、准确的筛查,是控制疫情以及为感染者提供及时治疗的有效方法。近年来,蛋白质生物标志物的识别和定量检测在癌症等复杂疾病的筛查、监测和预后等方面的作用越来越重要。作为引发新冠肺炎的特异性病原体,SARS-CoV-2在新冠肺炎的筛查中发挥着重要作用。其中,核衣壳蛋白(Nucleocapisd protein,N蛋白)是SARS-CoV-2的核心蛋白,其含量丰富且具有高度免疫原性(特异性强),因此被认为是新冠肺炎的重要生物标志物之一。由此可知,SARS-CoV-2 N蛋白的检测对新冠肺炎的早期筛查具有重要意义,为其开辟了新的思路和方法,是对其现有的临床检测方法的有效补充。表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技术能显著增强吸附在贵金属纳米结构上的生物样本产生的微弱拉曼光谱信号,具有比较高的检测特异性和近单分子水平的检测灵敏度。本论文利用SERS光谱结合其它技术,对新冠肺炎相关的生物标志物SARS-CoV-2 N蛋白进行检测研究,开发高灵敏定量检测的新方法,主要内容包括:1、利用SERS光谱结合侧向流动分析技术(lateral flow immunoassay,LFA)对新冠肺炎相关的生物标志物SARS-CoV-2 N蛋白进行方便快捷的高灵敏定量检测。由于SERS技术的引入,获得了比仅用肉眼观察颜色变化的传统LFA更低的检测限(limit of detection,LOD)。同时,便携式拉曼光谱仪的使用,使SARS-CoV-2 N蛋白的检测变得更加方便快捷,无需专业的实验室和操作人员,整个检测过程(约15min)比作为金标准的RT-PCR所需时间更短。此外,利用SERS-LFA可准确定量分析加标的唾液样本中SARS-CoV-2 N蛋白的浓度,表明该方法具有实际应用方面的可行性。SERS-LFA技术为新冠肺炎的检测提供了一种便捷高效的潜在手段,也为即时检测(Point of care,POCT)提供了新思路,促进了POCT技术的革新,为其发展铺平道路。2、制备了一种“三明治”型的SERS传感器,用于新冠肺炎生物标志物SARS-CoV-2 N蛋白的高灵敏检测和定量分析。通过合成均匀的二维SERS基底,使得收集到的SERS光谱信号更加均匀。合成的基底表面形貌较为粗糙,可提供大量“热点”,从而增强SERS光谱信号。此外,在基底表面修饰能与目标蛋白特异性结合的捕获抗体,提高检测的特异性。同时,SERS免疫探针将通过目标蛋白耦合在二维基底表面,形成抗体-抗原-抗体的“三明治”结构。SERS免疫探针与二维基底之间的等离子激元共振效应,进一步增强拉曼探针分子的信号,实现了对目标蛋白的高灵敏检测和定量分析。“三明治”型SERS传感器具有较高的灵敏度,优异的均匀性、高重现性,可大大地提高SERS检测的可靠性,并且在加标唾液样本中也展现出优异的检测效果,因此有望成为当前新冠肺炎相关生物标志物检测的理想补充方案。3、使用了一种基于磁富集SERS联用技术,用于新冠肺炎的生物标志物SARS-CoV-2 N蛋白的超灵敏定量检测。磁性纳米粒子(Magnetic Nanopaticles,MNPs)具有较高的比表面积和磁性,可以将目标分子有效地富集起来,从而提高了目标蛋白的检测灵敏度。通过表面修饰与目标蛋白特异性结合的捕获抗体形成磁性纳米探针,提高检测的特异性。同时,由于目标抗原与抗体的生物亲和识别作用,SERS免疫探针将通过目标蛋白耦合在磁性纳米探针的表面,形成一种核卫星结构SERS传感平台,用于揭示目标蛋白的浓度,具有优异的定量性能。同时,核卫星结构产生了更多的“热点”,从而放大SERS光谱信号,进一步降低检测限。通过实验结果表明,该SERS传感平台能够实现对SARS-CoV-2 N蛋白的超灵敏定量检测。本文将SERS光谱与LFA技术、二维SERS基底以及磁性纳米粒子相结合,对新冠肺炎的生物标志物SARS-CoV-2 N蛋白进行快速、超灵敏、定量检测,可以作为现有的新冠肺炎检测方案的有效补充。此外,可根据不同的使用场景和用户需求选择三者中更合适的实验方案,从而更好地监测疾病的恶化和控制疾病的流行。