关键词：
新型冠状病毒
免疫组库
灭活疫苗
侧向流动免疫层析
摘要：
目的:
新型冠状病毒具有高度传染性,对全球社会和经济造成前所未有的破坏。在疫情防控过程中,无症状感染者无明显临床症状与体征,在日常的诊疗工作中难以被发现,而无症状感染者仍然存在传染性,其导致的病毒传播难以预防,这对社会疫情防控是个巨大挑战;同时复阳病例的存在使得疫情变得复杂。既往有许多研究集中于新冠有症状患者和恢复期患者的免疫反应,而无症状感染者和复阳患者的免疫反应研究尚不清晰。因此,本研究利用免疫组测序方法,从基因层面较为全面地横向分析新冠感染者不同分型间的免疫机制,深入挖掘免疫组库与疾病的关系,有助于精准区分新冠不同分型患者,尽早对不同分型患者进行合适的防控工作管理和临床治疗干预。
疫苗接种是目前人类抗击新冠病毒的最重要方法,接种疫苗后体内会产生针对新冠病毒的特异性抗体,其中中和抗体可以阻断新冠病毒与宿主细胞表面ACE2的结合,从而使病毒不能入侵宿主细胞,通过检测体内新冠相关抗体的含量不仅可以评估新冠感染患者保护效力,还可以反应新冠疫苗接种后的免疫效果。因此,本研究拟建立一种快速、准确、灵敏的新型冠状病毒相关抗体免疫层析检测方法,用于检测新冠既往感染者、新冠疫苗接种者体内新冠抗体含量,评价疫苗保护效力和指导疫苗接种。
方法:
1.纳入11例无症状感染者、19例有症状患者、14例恢复期患者、10例复阳患者和16例健康对照者,收集外周血样本并进行免疫细胞计数,同时分离外周血单个核细胞并进行免疫组测序。本研究从读数、克隆型和V-J基因数量对测序结果进行比较,还通过D50指数和Shannon指数分析不同分型患者间多样性差异。其次,使用Spearman相关系数来评价受试者之间的V-J基因使用相似性。此外,还分析了新冠感染不同病程患者之间独有V-J基因表达的动态变化,以确定不同病程患者间是否存在潜在联系。
2.本研究采用双抗原夹心法原理,以红色乳胶微球为信号物标记RBD重组蛋白,再将另一 RBD重组蛋白包被在NC膜上作为检测线,基于此建立一种乳胶微球法的可视化免疫层析检测方法(immunochromatographic assay based on latex beads(LBs),LBs-ICA)。进行工艺条件优化后,分析其临床检测性能并与新冠活病毒微量血清中和试验(conventional virus neutralization test,cVNT)进行比较。
结果:
1.(1)复阳患者单核细胞、嗜碱性粒细胞和血红蛋白相较于健康对照组均显著降低,同时复阳患者与有症状组之间单核细胞和嗜碱性粒细胞有显著性差异。此外,复阳患者与恢复期患者间单核细胞存在显著差异。(2)克隆型AAPVFVLGLQAVSTDTQY在有症状组和无症状组均显著降低,且克隆型EGAGLLQYPPLSKLF在恢复期组和复阳组中的表达也显著降低。(3)在不同新冠感染者间的V-J基因使用相似性方面,以健康对照组为参照,有症状组和健康对照组之间的V-J基因使用差异最大。此外,无症状组与健康对照组显示出更高的基因相似性。进一步地,以复阳组为参考,无症状组表现出最高的基因使用相似性。(4)就新冠感染不同病程患者之间独有V-J基因表达的动态变化情况,将健康对照组的V-J基因表达作为参考基线,本研究确定了 73个V-J基因配对组合,在无症状组和有症状组中呈现单调递增趋势。进一步地,有单调递增趋势的73个V-J基因配对组合中,有一部分配对基因在复阳患者中也表现差异使用。
2(1)LBs-ICA灵敏度为7.8ng/mL,线性范围是7.8-500ng/mL;在554例阳性临床样本检测中,与cVNT相比阳性符合率为98.29%,阴性符合率为97.70%,总符合率为98.01%,kappa系数为0.96。(2)LBs-ICA与多种常见病原菌感染血清无交叉反应,重复性好(CV<10%),稳定性好,由加速老化实验估计可在室温稳定保存约1年。(3)LBs-ICA可溯源至新冠活病毒微量血清中和试验(cVNT)效价,根据阳性样本出现红色条带的最大稀释倍数与新冠抗体滴度之间有10倍的关系,如某未知样本出现红色条带的最大稀释倍数为80倍时,其对应的新冠抗体滴度为1:8,依此类推。
结论:
1.本研究发现无症状感染者和复阳患者中存在特异性的免疫机制,可以帮助临床对不同病程患者进行合适的防控工作管理、精准监测和靶向免疫治疗,对临床具有重要意义。
2.本研究建立了一种能溯源至新冠活病毒微量血清中和试验(cVNT)效价的新冠相关抗体乳胶法检测试纸条,该试纸条具有良好的灵敏度和特异性,检测结果准确,在评价疫苗效力和指导疫苗接种方面具有良好的应用前景。
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