关键词:
新型冠状病毒
细菌样颗粒
肌肉注射免疫
滴鼻免疫
免疫保护
摘要:
新型冠状病毒感染(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)是2019年底由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-Co V-2)感染引发的大流行传染病。COVID-19传播范围广、传播速度快、传染性强。2020年1月30日,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)宣布COVID-19为突发公共卫生事件,截止到2023年3月,全球COVID-19确诊人数超过7.5亿例,死亡人数超过685万例。安全有效的疫苗是预防和减少疾病传播的重要手段之一,根据WHO公布的数据,183种COVID-19疫苗已进入临床研究中,COVID-19疫苗探索性研究是当前的重点工作。本研究利用一种新型抗原制备技术GEM-PA表面展示系统制备SARS-Co V-2细菌样颗粒,构建一种表达SARS-Co V-2受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)蛋白的人用亚单位疫苗候选株,使用Adda Vax佐剂和Al(OH)佐剂肌肉注射免疫C57BL/6N小鼠并滴鼻免疫C57BL/6N小鼠,评价免疫原性及攻毒保护效果。***-RBD-GEM的构建及鉴定选取SARS-Co V-2武汉株的RBD区域进行密码子优化,与T4F基序进行连接,使其形成三聚体为主的高聚集态,再通过柔性Linker(GGGGS)与锚定蛋白(Protein Anchor,PA)相连接,并连接在p Fastbac1载体上。将P4代病毒进行间接免疫荧光鉴定和Western blot鉴定,间接免疫荧光结果显示感染P4代病毒的Sf9细胞可以看到绿色荧光信号;经过还原处理的P4代病毒上清和沉淀在55 KDa和70 KDa之间可以检测到目的蛋白,经过非还原处理后的上清和沉淀在100 KDa和130 KDa之间可以检测到目的蛋白,结果表明目的蛋白成功表达;经过煮沸的三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)处理的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,***)形成革兰氏阳性增强基质(Gram-positive enhancer matrix,GEM),与Trim-RBD蛋白结合后,经过SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光鉴定后,表明Trim-RBD-GEM成功表达;经过透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)的超薄切片鉴定后,可见***有细胞壁和均匀的内容物,经过TCA处理而得的GEM颗粒可见肽聚糖结构,但内容物变少,而结合后的蛋白附着在肽聚糖骨架上;经过薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)鉴定Trim-RBD-GEM的纯度超过97%。以上结果表明Trim-RBD-GEM构建成功,并成功表达目的蛋白。***-Co V-2细菌样颗粒Trim-RBD-GEM的实验免疫研究Trim-RBD-GEM联合Adda Vax佐剂和Al(OH)佐剂在第0、14和28天肌肉注射免疫C57BL/6N小鼠后,检测免疫后第10、24和38天血清中特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3抗体水平,结果发现Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠血清中特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3抗体水平均显著高于Trim-RBD-GEM&Al(OH)组、Trim-RBD-GEM、Trim-RBD组、GEM&Adda Vax组、GEM&Al(OH)组和Mock组,在首次免疫后第38天Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠血清中检测到特异性Ig G抗体效价最高为1:102400。使用SARS-Co V-2毒株检测各组小鼠血清中中和抗体水平,结果发现Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠血清中中和抗体水平显著高于其他组,在首次免疫后第38天Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠血清中检测到中和抗体效价最高为1:160。首次免疫后直到第四个月检测小鼠血清,结果发现在首次免疫后第60、90和120天后可见Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠血清中特异性Ig G抗体水平显著高于其他组,在首次免疫后第120天Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠血清中检测到特异性Ig G抗体效价最高为1:25600。在首次免疫后第60和90天的结果中可以看到Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠血清中中和抗体水平显著高于其他组。ELISpot结果发现,Trim-RBD-GEM&Adda Vax组小鼠脾淋巴细胞中