关键词:
新型冠状病毒
理化性质
生物信息学分析
重组腺病毒
摘要:
目的采用生物信息学方法分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重要结构蛋白S和N。将S基因和N基因融合并构建重组质粒,重组质粒与骨架质粒在293T细胞中包装后获得重组腺病毒,为利用其融合基因进行疫苗研发提供理论和实验依据。方法从NCBI数据库中获取S、N蛋白的基因组序列和氨基酸序列,采用生物信息学分析工具SOPMA、IEDB、BLAST、Immunomedicine Group、UniProt预测并分析S和N蛋白的理化性质、二级结构和三级结构、B细胞表位和T细胞表位、抗原决定簇以及相互作用蛋白。分别以S-pcDNA和N-pcDNA质粒为模板,以S-F1、S-F2和N-F3、和N-F4为引物PCR扩增目的基因;通过T4 DNA连接酶连接获得S基因和N基因的融合基因,以连接后的融合基因为模板,以S-F1和N-F4为引物采用重叠PCR扩增融合基因S-N。将融合基因S-N与穿梭表达载体pDC316-mCMV-EGFP连接,获得重组质粒,然后与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293T细胞,获得重组腺病毒。结果S蛋白由1269个氨基酸组成,分子式为C_(6325)H_(9752)N_(1654)O_(1886)S_(54),原子总数为19671,理论等电点pI为6.35;该蛋白含有一个跨膜长度为23个氨基酸序列的跨膜螺旋(1210-1232),二级结构以无规则卷曲(占43.89%)为主,属于稳定的疏水性蛋白;N蛋白由419个氨基酸组成,分子式为C_(1976)H_(3150)N_(608O629)S_(7),原子总数为6370,理论等电点pI为10.09;二级结构以无规则卷曲(占58.23%)为主,属于不稳定的疏水性蛋白。选择出S蛋白最具优势的抗原表位4个,选择出N蛋白最具优势的抗原表位3个;选出S和N蛋白Th表位各2个优势序列;选出CTL优势S蛋白表位HLA-A 2个,选出CTL优势N蛋白表位HLA-A 3个,HLA-B 2个;从S蛋白抗原决定簇选择3个优势抗原决定簇,从N蛋白选择出2个优势的抗原决定簇;获得10个与S蛋白相互作用的蛋白,6个与N蛋白相互作用的蛋白。在此基础上,成功构建了融合基因S-N重组腺病毒并HEK293T细胞中表达。结论S和N蛋白理化性质、免疫原性、抗原决定簇及同源性等均符合疫苗的基本要求,为SARS-CoV-2结构蛋白S和N融合基因重组疫苗的研究奠定了基础。