关键词：
新型冠状病毒
肺纤维化
机械通气
中期因子
血管紧张素转换酶2
摘要：
背景
新型冠状病毒感染（COVID-19）首要靶向呼吸系统,重症感染会造成严重的肺损伤甚至肺纤维化。COVID-19肺纤维化的发生是SARS-Co V-2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）感染后肺损伤最严重的表现,接受机械通气的重症患者发生率更高。因此,阐明COVID-19相关肺纤维化的病理生理机制,对指导如何最大程度地缓解COVID-19肺纤维化的发生和发展至关重要。
刺突蛋白（Spike protein,S蛋白）是SARS-Co V-2感染细胞的关键蛋白,主要介导病毒完成与宿主细胞受体结合以及膜融合的过程。S1蛋白是其重要亚基,负责特异性地识别和结合宿主细胞表面受体。血管紧张素转换酶2（ACE2）是SARS-Co V-2的主要受体,病毒通过S1蛋白与ACE2结合后内吞转运进入宿主细胞。ACE2是人血管紧张素转换酶ACE同源物,是肾素血管紧张素系统RAS（Renin-Angiotensin System）重要调控蛋白。ACE2是经典ACE的负调控因子,它可以降解Ang II成七肽Ang 1-7,故维持RAS系统ACE/ACE2动态平衡对调控肺纤维增殖具有重要作用。
中期因子（Midkine,MK）是一种肝素结合生长因子,具有促进细胞增殖分化、粘附迁移的作用,其在正常器官中的表达普遍较低,但在氧化应激、炎症和组织修复过程中会被强烈诱导表达。MK已被证明可以调节RAS系统,介导器官纤维化发生。本课题组前期研究表明,MK通过调节RAS信号通路,诱发ACE上调,在呼吸机相关ARDS肺纤维化中发挥重要作用。另外有研究表明,与健康志愿者相比,新冠ARDS患者的MK血浆水平显著升高。
基于以上研究背景,我们提出以下科学假设:新型冠状病毒S1诱导MK表达增加,激活ACE-Ang II信号通路,促进肺损伤后纤维增殖的发生。探讨MK-ACE-Ang II信号通路是否参与COVID-19相关肺纤维的发生发展,将有助于进一步认识COVID-19相关肺纤维化的分子机制,为COVID-19相关肺纤维化治疗提供新的药物靶点。
目的
1.明确接受机械通气COVID-19患者肺部发生纤维化的流行病学、预后及相关影响因素;探讨MK表达是否与COVID-19 ARDS患者病情严重程度以及肺纤维化发生相关;
2.通过在体动物实验,建立新型冠状病毒S1蛋白诱导机械通气小鼠肺损伤后纤维增殖模型;
3.进一步揭示MK-ACE-Ang II信号通路是否参与机械通气COVID-19相关肺纤维化的发生,发现可能的关键作用靶点,为防治COVID-19相关肺纤维化提供新靶点和新思路。
方法
1.临床研究:机械通气COVID-19相关ARDS肺纤维化的流行病学特点及相关的危险因素与预后分析
（1）回顾性收集2022年10月1日至2023年6月30日期间在广州医科大学附属第一医院重症医学科确诊为ARDS需要机械通气的患者共185例,按照是否存在新冠感染分为COVID-19 ARDS组111例和非COVID-19 ARDS组74例,比较两组人口学资料、肺部纤维化情况及临床结局。此外,针对研究中机械通气COVID-19相关ARDS患者111例,通过评估胸部HRCT是否存在间质纤维改变,分为纤维化组82例和非纤维化组29例,比较两组人口学资料、临床特征、实验室检测指标、并发症、治疗措施、危险因素及临床结局;
（2）检测患者血清MK水平,明确MK表达水平是否与COVID-19 ARDS患者病情严重程度以及肺纤维化发生相关。
2.动物实验:新型冠状病毒S1蛋白诱导机械通气小鼠肺纤维化模型的构建
野生型小鼠随机分组:生理盐水（NS）,S1蛋白400μg/kg,S1蛋白400μg/kg+HP（PIP 24cm H2O）,S1蛋白400`g/kg+LP（PIP 12cm H2O）,NS+HP（PIP 24cm H2O）组。在第3、7、14天处死小鼠,采集血液,BALF及肺组织。H&E、Masson染色评估肺组织病理改变;计算BALF总细胞数,检测BALF总白蛋白含量;Western blot检测肺组织蛋白ACE、ACE2、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平;免疫组化检测肺组织CollagenⅢ含量;检测肺组织羟脯氨酸含量;荧光共振能量转移法检测ACE2酶活性;Elisa法测定血清Ang II浓度。
3.动物实验探讨Midkine-ACE/Ang II通路在S1蛋白联合机械通气诱导小鼠肺损伤后纤维增殖中的作用及机制研究
野生型小鼠随机分组:1)NS+DMSO对照,2)S1蛋白+DMSO,3)S1蛋白+i MK,4)S1蛋白+LP+DMSO,5)S1蛋白+LP+i MK,6)S1
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