关键词： 单环碱基C-核苷类化合物   RNA依赖性RNA聚合酶   新型冠状病毒   傅克反应   设计   合成  

摘要： 新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）所引起的新型冠状病毒肺炎疫情（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）,自2019年12月12日武汉首位新型冠状病毒肺炎病患发病以来,在全球范围内迅速蔓延开来,并且对人类的生命健康造成了严重威胁。SARS-CoV-2感染通常会导致流感样症状,如咳嗽、发烧、喉咙痛、头痛、背痛、味觉丧失或嗅觉丧失等。截至2023年10月,全球已有超过7711万例COVID-19确诊病例,超过696万例COVID-19相关死亡病例。 在已报道的SARS-CoV-2的14个已知分子靶点中,血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme,ACE2）、RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）、木瓜蛋白酶样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)和主蛋白酶(Main protease,Mpro)受到广泛关注。核苷类药物在抗病毒和抗癌等化学治疗中有着广泛应用。与传统的N-核苷相比,C-核苷的特点是存在C-C糖苷键,使C-核苷类化合物具有更强的耐化学和酶水解性,因其不易被分解,从而在体内保持较长时间的活性。其中,单环碱基C-核苷类化合物具有结构稳定性,这种结构特征赋予了其在药物代谢过程中的优势,从而使其在药物化学领域具有应用潜力。 本文通过文献阅读并且参考含有糖苷结构的活性化合物的分子结构以及过往的药物研发经验,以噻唑福林（Tiazofurin）的结构作为主要参考,以Friedel-Crafts反应为关键步骤,实现了糖环和碱基的直接C-C偶联,以此构建了核心的C-核苷类母核,随后通过取代反应、偶联反应、Click反应等引入了结构多样并含有多个氢键给体和氢键受体的碱基结构,对碱基片段进行结构修饰,共得到了41个结构多样的单环碱基C-核苷类化合物。随后针对构建的小型分子化合物库,进行了细胞水平的抗病毒活性评价,未发现活性化合物。 综上所述,COVID-19的大流行对公众健康造成严重威胁。核苷类药物在抗SARS-CoV-2的化学治疗中有着广泛应用。其中,单环碱基C-核苷类化合物具有结构稳定性,在药物代谢过程中显示出的优势,使其在药物化学领域具有应用潜力。本文旨在以具有抗病毒活性的C-核苷类化合物的结构作为参考,开发简单通用的单环碱基C-核苷类化合物的合成方法,进一步拓展C-核苷类化合物的结构多样性,以推动未来抗病毒药物的研发工作。本文虽未筛选出具有抗新型冠状病毒活性的化合物,但为后续设计并合成具有抗病毒活性作用的化合物提供了参考和借鉴。

关键词： 新型冠状病毒   细胞融合   新冠感染合胞体   衰老相关分泌表型   SNAI1  

摘要： 2019年以来,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的肺炎疫情在全球范围内广泛流行,对全球的公共卫生体系造成严重威胁。近年以来,尽管我们对新冠病毒的结构、入侵机制、致病特点和治疗手段的研究逐渐深入,但在当前与病毒共存的大背景下,新冠肺炎的广泛流行、变异毒株的不断进化仍然给我们的日常防护和临床治疗带来严峻挑战,新冠病毒引发的重症感染以及一些后遗症仍旧对患者生命健康和生活质量造成威胁。 新冠重症感染的显著特征之一是肺部存在明显的由细胞融合形成的合胞体。合胞体的形成又被称作合胞体化,融合在一起的细胞最终产生多核巨细胞,其大小从几个到几十个细胞不等。研究表明新冠病毒感染引起的肺部合胞体的数量和体积是决定患者病情严重程度的关键。早期流行的重症率较高的Alpha、Beta和Delta等毒株显示出了较原始毒株更强的合胞体形成能力,而重症率较低的Omicron毒株造成细胞融合的能力则明显降低,这是合胞体形成与感染严重程度呈现正相关关系的直接证明。 新型冠状病毒介导产生的合胞体,主要依赖于新型冠状病毒表面刺突蛋白与宿主细胞表面ACE2受体之间的相互作用。S蛋白S1亚基的受体结合区负责识别宿主细胞表面ACE2受体,从而完成病毒与细胞结合的过程,而S2亚基则负责将病毒外包膜与人类细胞膜进行融合,从而实现病毒入侵的全过程。入侵的病毒则利用宿主细胞器完成生命周期并合成新病毒释放到周围环境,新合成的S蛋白继续与邻近细胞膜上的ACE2受体结合并使多个细胞融合,促使合胞体的形成。 虽然目前已有报道的研究结果表明,由新冠病毒S蛋白介导产生的融合细胞能够发生凋亡或者焦亡,但我们前期实验中发现部分合胞体能够长期存活,利用β-半乳糖苷酶染色研究发现这部分存活的合胞体发生了细胞衰老。本课题在发现和表征新冠病毒感染的合胞体发生衰老现象的基础上,对决定合胞体命运的分子机制进行深入研究。 1、建立4种新冠融合细胞系模型和融合程度定量方法 通过慢病毒包装和感染技术在细胞中分别过表达S和ACE2,成功构建了4种SARS-2-S融合细胞系模型(A549/293FT/He La/HIEC-6)。利用互补Lac Z原理建立了细胞融合程度的定量方法,比较了多种新冠病毒S蛋白突变体的致细胞融合能力。 2、新冠病毒S蛋白介导产生的合胞体出现衰老表型 利用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色对共培养不同时间的合胞体衰老情况进行观察并分析,结果表明存活的新冠感染合胞体衰老染色结果阳性,提示这部分存活的新冠感染合胞体发生了细胞衰老;进一步研究发现,BPTES、Fisetin和Venetoclax等具有抗衰老潜力的抑制剂可显著抑制衰老合胞体的存活。 3、通过转录组测序发现多种衰老标志基因在合胞体表达水平上升 研究发现新冠病毒感染引起的合胞体细胞形成在早期和晚期均伴随着多种关键基因的显著上调和下调,其中经典细胞衰老标志基因CDKN1A随融合程度显著上调,而细胞增殖标志基因MKI67则显著下调,IL6、IL8、MMP3和MMP9等衰老相关分泌因子均显著上调。 4、衰老的合胞体加重心力衰竭 研究发现新冠假病毒感染的小鼠,其心脏射血分数明显下降,心衰指标上调明显,心肌细胞损伤,炎症指标上调,表明衰老的心肌细胞合胞体促使炎症因子释放增加,最终导致心力衰竭。 5、TNF信号通路促进合胞体细胞走向衰老而非死亡 针对4 h和48 h的合胞体细胞转录组学数据分析的结果表明,融合时与细胞存活显著相关的信号通路TNFα-TNFR2及其下游关键效应蛋白显著升高,抑制该通路的下游关键信号分子c IAP2后会导致合胞体细胞的损伤,而增加TNFα信号的表达会促进合胞体细胞走向衰老,表明TNF信号通路在合胞体细胞衰老命运中发挥关键作用。 6、SNAI1是调控合胞体衰老命运的关键靶标 转录组学数据结果显示,SNAI1的表达随着融合程度的增加而上调,提示其在合胞体的形成和衰老过程中发挥重要作用。而抑制SNAI1的表达或功能后,合胞体的存活率和衰老率显著降低,表明SNAI1是抑制合胞体存活和衰老的关键靶标。 综上所述,本研究发现并表征了新冠感染合胞体的衰老命运,并发现了TNFα-TNFR2通路和SNAI1是调控合胞体命运的关键靶点,抑制TNFR2和SNAI1能够有效干预合胞体的衰老命运,研究成果为降低新冠患者重症率和减轻减少新冠后遗症提供了新的思路。

关键词： 新型冠状病毒   长新冠   单细胞转录组测序   单核细胞  

摘要： 呼吸道病毒常导致新发传染病,严重危害全球健康,是全球公共卫生优先关注的重要领域。2020 年新型冠状病毒(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)被发现,导致全球暴发疫情。SARS-CoV-2感染者在康复后的较长时间仍存在疲劳、气促、咳嗽、嗅味觉异常等多种后遗症,被称为长新冠(Long COVID)。目前认为免疫功能紊乱、微生态失调、自身免疫、微血栓和神经信号通路异常是长新冠发生的可能机制。已有的关于长新冠发生机制的探索多基于横断面研究,缺少在较长时间尺度下通过个体随访精细地分析长新冠发生的机制。本研究通过建立SARS-CoV-2感染患者的长期随访队列,在单细胞分辨率揭示患者从急性期到恢复期外周血免疫细胞的动态变化,探索后遗症发生的炎症驱动机制。本研究纳入的新冠肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)患者来自武汉金银潭医院。在其住院、感染后半年、一年、两年和三年进行随访,采集外周血进行单细胞转录组测序(Single-cell RNA sequencing,scRNA-seq),用液相芯片方法检测血浆细胞因子。 急性期共纳入47例住院患者,其中10例在半年和一年被随访两次,9例在半年到三年被随访4次,共采集136份血样本。79.4%(27/34)的COVID-19患者在半年随访时患有长新冠,其血浆中细胞因子和趋化因子在一年随访时仍显著高于健康对照人群。经scRNA-seq共注释到外周血单个核细胞中的36个细胞亚群。基于Ro/E分析,发现幼稚T细胞、粘膜相关不变T细胞(Mucosal-associated invariant T,MAIT)细胞、γδT细胞、杀伤性T细胞和单核细胞的比例在一年随访时仍与健康对照存在显著差异。 首先,基于富集分析、时序性比较分析和关联分析,发现CCL3+S100Ahigh经典单核细胞比例在急性期显著升高,该类细胞富集白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和巨噬细胞炎症蛋白-1α等促炎基因,与血浆中对应炎症因子水平呈正相关,提示该类细胞是驱动急性期炎症的主要细胞亚群。CCL3-S100Ahigh经典单核细胞的比例在感染后的恢复期持续升高,该类细胞中上述促炎基因的转录水平较低,与血浆中对应炎症因子水平呈负相关,表明其在恢复期发挥抑炎作用。 在急性期以CLQ-和CDKN1C+为特征的非经典单核细胞比例在重症和危重症COVID-19患者中升高,这一细胞亚群比例在一年随访时持续高于健康对照。该群细胞转录肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ诱导蛋白10和粒细胞集落刺激因子等促炎基因,与血浆中对应炎症因子水平呈正相关,功能富集分析表明其发挥黏附浸润和跨内皮迁移功能。基于单细胞RNA速率和NicheNet调控配体分析,表明C1Q+非经典单核细胞是CDKN1C+非经典单核细胞的前体,IL1B、VEGFA、TGFB1等配体特异性调控两者间的转化。用IL-1β刺激分离培养的非经典单核细胞可上调CDKN1C+非经典单核细胞的数量。该类细胞与肺部影像学异常以及关节疼痛等长新冠症状的发生有关,提示该类细胞是驱动长新冠症状的主要免疫细胞。基于独立验证队列进行上述结果的确证。基于37例随访病例,用流式细胞术证实CDKN1C+非经典单核细胞在有肺部影像学异常以及关节疼痛的长新冠患者中富集。基于50例随访患者的转录组数据,表明存在关节疼痛的随访患者中CDKN1C的转录水平更高。基于48例患者,用细胞内染色方法证实CDKN1C+非经典单核细胞中高表达多种炎症因子。 CDKN1C+非经典单核细胞的比例与CD4+和CD8+幼稚T细胞、MAIT细胞和γδT细胞的比例呈负相关。上述T细胞在COVID-19急性期耗竭且与疾病严重程度相关。ZNF683+CD8+T细胞和GZMK+ CD4+T细胞在一年随访时持续克隆扩增。在半年至一年随访期间,特异性结合巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)抗原的TCR显著增多,提示杀伤性T细胞的持续克隆扩增与CMV的潜伏激活有关。 CDKN1C+非经典单核细胞和CD4+幼稚T细胞的比例在两年随访时恢复正常,ZNF683+CD8+T细胞的比例在三年随访时恢复正常,CCL3+S100Ahigh经典单核细胞、CCL3-S100Ahigh经典单核细胞、C1Q+非经典单核细胞、CD8+幼稚T细胞、γδT和MAIT细胞在三年随访时仍与健康对照显著不同。 综上,本研究基于单细胞分辨率表征了 COVID-19康复患者在急性期和恢复期外周血免疫细胞的组成和功能,鉴定出CDKN1C+非经典单核细胞与长新冠慢性炎症、肺部影像学异常和关节痛密切相关。明确COVID-19患者从急性期向慢性炎症转变的免疫病

关键词： 慢性咳嗽   上气道咳嗽综合征   咳嗽变异性哮喘   病因分析   慢性咳嗽   临床特征   高危因素   新型冠状病毒  

摘要： 背景与目的:慢性咳嗽是呼吸专科常见问题,既往误诊率较高,患者被反复进行各种无意义的检查,给患者带来巨大的疾病负担。中华医学会呼吸分会先后发布了慢性咳嗽诊疗指南三版,以规范临床医师诊疗行为。本研究对2018.1至2022.12在武汉市第四医院就诊的成年慢性咳嗽患者的病因进行回顾性分析,以分析武汉地区慢性咳嗽的病因的分布特点。 方法:收集2018.1至2022.12在武汉市第四医院门诊及住院的304例成年慢性咳嗽患者的临床资料,根据2021版慢性咳嗽诊断标准以及三步法经验性诊疗策略,多次随访评估疗效后以确定慢性咳嗽病因,对临床资料进行病因分析。 结果: 1.女性慢性咳嗽患病率高于男性,且约为男性的2倍,在169例慢性咳嗽患者中,男性主要分布于60～70岁,有22例(37.9%),女性主要分布于50～60岁,有39例(35.1%)。 2.男性组中FeNO值较女性组明显升高(57.42±32.45 vs 39.61±32.00,P<0.01)。FeNO值在CVA组最高,AC组次之,UACS再次,GERC最低。FeNo指标两两比较,差异有统计学意义(51.5(36,70.5)vs 21.0(18,25)vs 29(16.8,34.2)vs 17(13,32),H=18.313,P<0.01)。 3.在304例慢性咳嗽患者中,274例患者确定了慢性咳嗽病因(90.1%)。在274例慢性咳嗽患者中,236例患者确定为单病因所致慢性咳嗽,38例为双病因或多病因导致的慢性咳嗽。单一病因所致的慢性咳嗽主要有咳嗽变异性哮喘(CVA)91例(29.9%)、上气道咳嗽综合征(UACS)44例(14.5%)、变应性咳嗽(AC)57例(18.8%),胃食管反流性咳嗽(GREC)23例(7.6%),嗜酸性粒细胞性支气管炎(EB)11例(3.6%)及血管紧张素酶抑制剂(ACEI)相关性咳嗽7例(2.3%);在多病因的慢性咳嗽患者中,CVA合并UACS 6例(2%),CVA合并AC 5例(1.6%),CVA合并GREC有3例(1.0%),UACS合并GERC有5例(1.6%)。 结论:慢性咳嗽患者女性较男性多见,FeNO对慢性咳嗽的病因诊断有指导意义。304例慢性咳嗽患者中,最常见病因为CVA,其次为UACS、AC、EB,血管紧张素酶抑制剂(ACEI)相关性咳嗽、感染后咳嗽(PIC)亦是慢性咳嗽的病因之一。 背景与目的:自2022年末疫情管控放开后,咳嗽门诊就诊率高居第一,进一步加重了慢性咳嗽患者的疾病负担,慢性咳嗽患者感染新冠的诊疗及预后需要临床医师的重视。现分析武汉地区慢性咳嗽的病因的分布特点及慢性咳嗽患者感染新型冠状病毒的咳嗽特征,探讨感染新冠病毒可能影响其咳嗽负担的高危因素,为慢性咳嗽患者的Long COVID的防治提供依据。 方法:选择某三级医院临床数据库中2018年1月至2022年12月的304名慢性咳嗽患者参与问卷调查,以2022年12月疫情放开后慢性咳嗽感染新冠的患者为研究对象(简称CC-Cov),慢性咳嗽非新冠感染患者(简称CC-Ncov)为对照,分别采用莱切斯特咳嗽问卷(LCQ),其包括咳嗽生理评分(PCS)、咳嗽心理评分(MCS)、咳嗽社会评分(SCS)三方面。采用多重线性回归分析影响CC-cov患者LCQ的高危因素。 结果:与CC-Ncov组的LCQ(19.98±1.39)比,CC-Cov组的LCQ(15.90±2.91)显著性降低,p<0.01。CC-Cov组分层分析表明,不同BMI的CC-Cov患者的PCS(BMI<18.5 vs 18.5-23.9 vs≥23.9kg/m2:4.46±1.13 vs 4.90±0.88 vs 4.41±0.90)差异具有统计学意义,p<0.05;与冠心病患者的PCS(5.45±0.28)比,非冠心病患者的PCS(4.86±0.99)差异具有统计学意义,p<0.05;与正常FEF50%(≥80%)患者的PCS(4.97±0.90)比,低FEF50%(<80%)患者的PCS(4.32±0.83)差异具有统计学意义,p<0.05;与正常FEF75%(≥80%)患者的PCS(5.13±0.75)比,低FEF75%(<80%)患者的PCS(4.51±0.93)差异具有统计学意义,p<0.05。多重线性回归分析,FEF50%是PCS、LCQ的预测因素,标准化偏回归系数分别为0.331、0.288。 结论:感染新型冠状病毒是影响慢性咳嗽患者咳嗽负担的重要因素;FEF50%可能是慢性咳嗽患者感染新冠后咳嗽负担加重的高危因素。

关键词： 新型冠状病毒   非结构蛋白7   线粒体损伤   突触可塑性   认知功能障碍  

摘要： 目的:阐明新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的非结构蛋白7(Nsp7)对神经元和小鼠认知功能的影响,并探索其可能的分子机制。为认识和理解SARS-CoV-2感染引起的认知功能障碍提供新的思路。方法:在武汉病毒所的武汉国家生物安全(三级)实验室中,通过SARS-CoV-2感染神经元细胞系SH-SY5Y或者病毒非结构蛋白表达载体过表达于SH-SY5Y及小鼠原代神经元,进行以下检测:Western blot检测神经元相关蛋白的表达水平,细胞核质分离、线粒体分离,WB和免疫荧光实验检测Nsp7蛋白定位;流式细胞术检测线粒体活性氧和膜电位;化学发光检测ATP水平;MTT法测定细胞活力。在C57BL/6小鼠腹侧海马CA1区立体定向注射AAV-GFP-Nsp7和AAVGFP,三周后进行新事物识别、巴恩斯迷宫以及条件恐惧等行为学检测;高尔基染色检测海马CA1区神经元的树突棘密度;Western blot检测突触相关蛋白水平。结果:首先,我们发现SARS-CoV-2感染可致SH-SY5Y细胞突触蛋白水平明显下降。SH-SY5Y中过表达所有非结构蛋白(Nsps)进行筛选,结果显示Nsp7显著降低突触蛋白synapsin-1水平。在SH-SY5Y细胞和小鼠原代神经元细胞中不同浓度过表达Nsp7,发现突触蛋白水平呈现Nsp7浓度依赖性降低,而MTT检测结果提示Nsp7不影响神经元细胞活力。为了验证Nsp7是否影响认知功能,应用腺相关病毒在C57BL/6小鼠腹侧海马CA1区表达AAV-GFP-Nsp7,行为学检测结果显示Nsp7可降低小鼠的记忆功能;脑组织分析显示小鼠树突棘密度和突触蛋白水平也降低。进一步探索其机制,对过表达Nsp7的SH-SY5Y细胞进行分析,发现Nsp7可损伤线粒体、上调ROS产生并导致ATP减少。在细胞中添加ROS抑制剂乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine NAC)后,Nsp7诱导的突触蛋白减少被抑制。结论:以上研究结果提示,SARS-CoV-2的非结构蛋白Nsp7可通过损伤线粒体,增加ROS和减少ATP的产生,降低神经元突触可塑性,诱发认知功能障碍,诱发相关神经症状。本研究将在一定程度上为认识和理解SARS-CoV-2损伤神经系统提供新的线索和思路。

关键词： SARS-CoV-2   病毒样颗粒   杆状病毒-昆虫细胞表达系统   鞭毛蛋白佐剂   免疫原性  

摘要： 由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（Coronavirus disease 2019,COVID-19）至今仍未停止变异与传播,疫苗是预防病毒传染的最有效方式之一,相比于传统的疫苗,病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）疫苗安全性更高,可引起机体较强的免疫反应。SARS-CoV-2的膜蛋白（Membrane,M）和包膜蛋白（Envelope,E）可组装形成VLPs,而刺突蛋白（Spike,S）由S1和S2两个亚基组成,其中S1中的受体结合域（Receptor binding domain,RBD）与宿主细胞膜上的血管紧张素转换酶2（ACE2）介导病毒进入宿主细胞,诱导机体产生中和抗体,是疫苗研发的关键靶点。杆状病毒表达系统表达VLP,相较于哺乳动物细胞表达系统,成本更低,易于大规模生产。沙门菌鞭毛蛋白是先天性免疫系统的有效激活剂,其佐剂活性在许多抗原中得到验证。因此,本研究通过杆状病毒表达载体系统纯化SARS-CoV-2 RBD蛋白,并制备获得VLPs疫苗,通过小鼠模型,评价其与鞭毛蛋白（Fli C）佐剂混合使用的免疫原性,为安全、有效的COVID-19疫苗研发提供理论基础。 ***-CoV-2 RBD在昆虫细胞中的可溶表达及鉴定 利用同源重组技术构建重组质粒pFastBac1-gp67-RBD。通过杆状病毒表达系统的Bac-to-Bac技术,筛选获得重组杆状病毒P3-RBD,利用间接免疫荧光试验和Western Blotting方法检测目的蛋白的表达,经过Ni2+柱亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western Blotting方法鉴定纯化的RBD蛋白,并通过ELISA鉴定RBD蛋白的ACE2结合活性。结果显示,重组质粒pFastBac1-gp67-RBD构建成功;重组病毒P3-RBD感染Sf9细胞后出现特异性绿色荧光;纯化后的RBD蛋白条带单一,能与Anti-RBD多克隆抗体发生特异性反应,并且与ACE2蛋白具有较高亲和力。综上,本研究在昆虫细胞中成功表达SARS-CoV-2 RBD蛋白,获得了高纯度、具有良好免疫反应性和生物活性的RBD抗原,为COVID-19疫苗开发提供了重要的生物材料。 ***-CoV-2病毒样颗粒的构建与鉴定 成功构建重组质粒pFastBac1-S和pFastBac-Dual-ME,通过Bac-to-Bac技术筛选制备重组杆状病毒P2-S和P3-ME。将重组杆状病毒分别感染昆虫Sf9细胞,通过间接免疫荧光试验与Western Blotting方法鉴定S、M和E蛋白表达水平,结果显示,使用Anti-RBD多克隆抗体孵育后,P2-S感染后的Sf9细胞可观察到明显的特异性绿色荧光,分别使用Anti-His和Anti-Flag单克隆抗体孵育后,P3-ME感染后的Sf9细胞也均可观察到特异性绿色荧光,Western Blotting结果显示,S、M和E蛋白均成功表达。将P2-S和P3-ME共同感染Sf9细胞后,利用蔗糖密度梯度超速离心法,纯化细胞裂解上清中的VLPs,透射电镜可观察到具有明显的冠状结构的球形颗粒,免疫电镜观察到胶体金颗粒附着在冠状结构表面,表明VLPs组装成功。此外,Western Blotting结果显示VLPs中含有S、M和E蛋白;ELISA结果显示SARS-CoV-2 VLPs与ACE2蛋白具有较高亲和力。综上,本研究利用Sf9细胞成功表达并组装具有生物活性的SARS-CoV-2 VLPs。 ***-CoV-2病毒样颗粒候选疫苗的免疫原性分析 成功提取鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（Fli C）,经Western Blotting鉴定其具有良好的免疫反应性,可用作VLP疫苗佐剂。以6-8周龄BALB/c雌性小鼠为模型,通过腹腔注射免疫纯化后的VLPs,并设置鞭毛蛋白Fli C佐剂组（VLPs+Fli C）和Alum佐剂组（VLPs+Alum）。分别在二免和三免12天后采集血清检测抗体应答水平,结果显示,二免和三免后,VLPs免疫组的Ig G抗体水平均显著高于PBS组,VLPs+Fli C和VLPs+Alum免疫组的Ig G抗体水平均显著高于VLPs免疫组。三免后VLPs免疫组的Ig G1和Ig G2a抗体水平均显著高于PBS组。三免2周后检测小鼠血清中和抗体,结果显示,与PBS组相比,VLPs组中和反应显著升高,VLPs+Fli C、VLPs+Alum组的中和反应显著高于VLPs组。此外,VLPs+Fli C和VLPs+Alum组小鼠血清抑制率显著高于单独VLPs免疫组,表明其能诱导高水平中和抗体应答。三免后14天采集脾脏

关键词： 注意力机制   新冠肺炎   医学影像   图像分割  

摘要： 近年来,深度学习在各领域广泛运用,通过医学图像分割技术可以有助于医生快速对病变区域进行量化分析及诊断,从而制定更精确的治疗计划。但是,在临床实践中,由于各类疾病、不同成像技术和患者个体差异的影响,医学图像分割模型往往显示出较低的鲁棒性和泛化能力。尽管U型网络(U-Net)作为一种广泛应用的病变分割架构,它在特征表达方面仍有所局限,导致分割结果不精确。构建能够应对新冠肺炎肺部大目标和小目标病灶分割的模型是一项极具挑战性的任务。为此,本文提出了基于自适应三重注意力机制(ATA)以及极化自注意力机制(PSA)的U-Net网络模型,并在两种不同类型的医学影像数据集上实现了病灶的精确分割。主要研究工作如下: (1)针对大目标病灶分割不精确的问题,提出基于自适应三重注意力机制的U-Net网络模型。首先对数据集进行划分,将不同数据集放入更加适应的网络中进行训练,然后用U-Net模型训练数据集,得出并观察训练后的数据集分布,初步以此设定较优的像素值比例,低于该值的分为小目标病灶,高于该值的分为大目标病灶,用U-Net进行训练不同像素值比例下的模型性能,得出更优的比例值。最后将改进的三种注意力模块添加至跳跃连接处,通过自注意力机制以及该连接层的通道数目,计算在该跳跃阶段注意力模块应采用的卷积核大小,低阶层使用大卷积核,高阶层使用小卷积核。这样不仅能够实现跨维度交互,还能针对性提取各级特征,有助于分割大目标病灶。 (2)针对小目标病灶识别困难以及分割精度较低的问题。本文提出基于极化自注意力机制的PSA-UNet,首先在U-Net跳跃连接处添加PSA模块,用于聚焦重要特征,其次,在编码器第四层加入SAM模块,有助于从所有编码器阶段提取空间特征,识别小目标病灶。最后,为了更加准确分割目标病灶,我们使用Io U损失函数和二进制交叉熵损失函数的组合来优化训练。实验结果表明,相较于其他网络分割模型,该模型在多种数据集上有更好的识别和分割性能,验证了构建模型的有效性。 图[27]表[9]参[74]

关键词： 新冠肺炎   抗体   疫苗   淋巴细胞   细胞因子  

摘要： 目的: 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由严重急性呼吸系统综合症-冠状病毒-2（SARS-CoV-2）引起的,在世界范围内传播的病毒性传染病。本研究是对COVID-19患者在出院恢复期和接种SARS-CoV-2疫苗后机体的免疫反应进行纵向研究,分析自然免疫、疫苗诱导免疫和SARS-CoV-2感染后进行相应的疫苗接种（混合免疫）后机体获得性免疫水平的变化,以了解三种不同的免疫途径引起的细胞和体液免疫反应在维持时间和强度方面的差异。本研究旨在探究COVID-19免疫学特征和COVID-19感染后对健康的长期影响之间复杂的关系。 方法: 随机选取重庆市红十字会医院（江北区人民医院）于2020年2月-3月确诊的34例新型冠状病毒（武汉株）患者和30例健康对照人群,采集感染后10-13个月和20-23个月的2份恢复期血样;其中第一份采集于感染后10-13个月（M10-13）的血样为在接种SARS-CoV-2疫苗前,而第二份采集于感染后20-23个月（M20-23）的血样为在接种SARS-CoV-2疫苗后。同时收集研究对象人口学基本信息、流行病学资料和临床信息。采用磁微粒化学发光法（Chemiluminescent immunoassay,CLIA）检测血清中SARS-CoV-2特异性总抗体、抗-NP IgG和抗-NP IgM抗体（Ab）;采用酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中SARS-CoV-2特异性抗-S IgG和抗-RBD IgG抗体;通过假病毒中和实验（Pseudovirus neutralization test,pVNT）检测对Delta和Omicron毒株的中和抗体;利用流式细胞术（Flow cytometry,FC）检测淋巴细胞亚群和TH1相关细胞因子。对检测结果进行统计分析,P值<0.05认为有统计学差异。 结果: 我们的数据显示,COVID-19恢复期患者从疫苗接种前（M10-13期间）到疫苗接种后（M20-23期间）SARS-CoV-2特异性抗体反应的平均滴度有明显变化,包括SARS-CoV-2特异性总抗体从219 AU/mL增至750.9 AU/mL;抗NP IgM从3.5 AU/mL显著下降（p<0.001）至0.6 AU/mL;抗NP IgG从7.9 AU/mL增至87.1 AU/mL;抗-S IgG从499.0RU/mL增至1802.3 RU/mL;对Delta变体的几何平均中和滴度（GMTs）从37.8增至316.0;对Omicron变体的GMTs从18.7增至240.2。而健康对照组,在疫苗接种后,其SARS-CoV-2特异性抗-S IgG、抗-RBD IgG、对Delta和Omicron变体的GMTs水平与COVID-19恢复期患者在疫苗接种前的水平几乎相等,但低于COVID-19恢复期患者疫苗接种后的水平。Omicron相对于Delta表现出大约两倍的免疫逃逸性。我们的研究结果表明,疫苗类型会影响血清抗体水平。在灭活疫苗组中,COVID-19恢复期患者的抗-S IgG的平均吸光度值（MAV）在疫苗接种后比疫苗接种前高2.08倍,比接种疫苗后的健康对照组高3.84倍;蛋白亚单位疫苗组中,COVID-19恢复期患者抗-S IgG的MAV在疫苗接种后比疫苗接种前高7.67倍,比接种疫苗后的健康对照组高7.01倍。我们的研究还显示,疫苗接种的剂数也会影响血清抗体水平。接种一剂疫苗的患者组抗-S IgG的MAV在疫苗接种后比疫苗接种前高4.46倍;接种多剂疫苗的患者组抗-S IgG的MAV在疫苗接种后比疫苗接种前高2.77倍,比接种多剂的健康对照组抗-S IgG的MAV高4.71倍。显示接受超过一剂疫苗并没有引起更高的抗体水平,这表明一剂疫苗可能对这些人来说足够了,同时需要更大的样本量来确定/比较重组亚单位疫苗的更好免疫效果。此外,分别与接种疫苗前和接种疫苗后的健康对照组相比,患者组的CD3+和CD8+T淋巴细胞数量在两个时期内均有所下降。患者组的大多数细胞因子在两年内恢复正常,但IL-6水平显著升高;细胞因子的变化可能是由SARS-CoV-2感染或接种疫苗引起的。有合并症的患者在接种SARS-CoV-2疫苗后,和没有合并症的患者相比,CD3+和CD8+T淋巴细胞减少,抗体滴度降低。 结论: 我们的研究结果显示,SARS-CoV-2感染后自然免疫和疫苗诱导特异性免疫应答的动态趋势是,大部分COVID-19患者在感染后至少10-13个月保持抗-NP、抗-S IgG、抗-RBD IgG和总抗体,自然免疫后诱导的抗体水平至少在一年内降低SARS-CoV-2再感染的风险。同时显示患者恢复期免疫接种（混合免疫）的有益效果。另外,

关键词： 新型冠状病毒   木瓜样蛋白酶   DEAD-box解旋酶3   DEAD-box解旋酶5   抗病毒天然免疫  

摘要： 研究目的: 严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的严重呼吸系统疾病给人类社会造成巨大危害,该病毒基因组编码序列保守的蛋白酶PLpro,在病毒的感染与复制过程中发挥关键作用,是针对SARS-CoV-2药物开发的重要靶点之一。宿主因素在SARS-CoV-2感染复制过程中的作用与机制亟需深入探索;已有研究发现,PLpro通过多种机制与宿主因素发生相互作用。本文拟发现能够与PLpro发生相互作用的宿主分子,并探索相关的机制和生物学意义,尝试为SARS-CoV-2宿主靶向药物发现或新型诊疗方案研究提供理论依据。 研究内容: 本文主要研究SARS-CoV-2 PLpro与宿主分子的相互作用,筛选能够与PLpro发生相互作用的宿主分子,并考察相互作用对病毒蛋白酶功能及宿主抗病毒天然免疫的影响和机制。 研究方法: 1.采用邻近蛋白标记技术结合液相色谱-串联质谱(HPLC-MS-MS)分析,筛选与SARS-CoV-2 PLpro/3CLpro相互作用的宿主蛋白质,通过GO分析对其进行功能富集,采用免疫荧光及免疫共沉淀技术考察PLpro与宿主互作蛋白的胞内结合及定位情况。 2.采用多种方法探索PLpro与宿主分子相互作用对抗病毒天然免疫的影响。采用双荧光素酶报告基因技术,考察DDX3/5对PLpro调控IFN-β抗病毒天然免疫通路的影响;采用免疫共沉淀方法考察PLpro对宿主蛋白质泛素化修饰和DDX3相关信号传导复合物、RNA m6A写入复合体DDX5-METTL3形成的影响;采用dot-blot及RNA衰变测定等技术检测PLpro对DDX5调控宿主RNA m6A修饰的影响;采用MeRIP-seq方法结合GO、KEGG分析,研究PLpro诱导宿主差异m6A修饰基因及其涉及的生物过程及细胞功能,考察PLpro对宿主RNA m6A修饰的影响。 3.采用双荧光素酶报告基因技术构建PLpro酶切底物质粒,考察DDX3/5对PLpro蛋白酶切割活性的作用,分析相互作用可能对病毒复制产生的影响。 4.利用AAV载体获得表达PLpro的腺相关病毒,经尾静脉注射入小鼠体内,通过病毒刺激诱导小鼠肺损伤,通过HE染色技术观察PLpro对小鼠肺组织炎性损伤的影响,采用多重免疫组化技术考察小鼠肺组织IFN-β表达情况。 研究结果: 1.发现DDX3/5与PLpro发生相互作用。通过邻近蛋白标记技术结合质谱分析,获得约1200个SARS-CoV-2 PLpro的潜在相互作用宿主蛋白;对质谱结果进行GO分析发现5个蛋白质分子参与了高置信度的生物过程,对此5个分子进行细胞内免疫荧光和Co-IP验证,发现DDX3及DDX5可能与PLpro发生相互作用。 ***5可能对PLpro负调控宿主抗病毒天然免疫发挥协同效应。检测DDX5对PLpro调控抗病毒天然免疫的影响,发现DDX5对PLpro负调控宿主IFNβ天然免疫通路发挥协同效应,共同抑制IFN-β、ISRE、PRD(Ⅲ-Ⅰ)4启动子活性,抑制P65磷酸化和NF-κB通路活化。探索机制发现,PLpro能够增强DDX5-METTL3的相互作用和METTL3表达,参与DDX5对RNA m6A修饰水平的调控,并参与促进P65及IKKγ mRNA的降解。MeRIP-seq检测发现,PLpro可使22个宿主基因RNA的m6A修饰水平发生显著变化,GO及KEGG分析发现差异修饰分子涉及多条抗病毒免疫通路。 ***对DDX3活化的Ⅰ型干扰素表达通路发挥负调控作用。考察DDX3对PLpro调控Ⅰ型干扰素通路的影响,发现DDX3显著激活了 IFN-β表达通路,而PLpro和PLpro-TM对DDX3活化的IFN-β通路表现出负调控效果。对其机制进行解析发现,PLpro能够抑制DDX3-TBK1-IKKε、DDX3-MAVS复合体的形成及DDX3的泛素化修饰。 ***3/5能够增强PLpro的酶活性。考察DDX3/5对PLpro酶活性的影响,发现DDX3/5能够增强PLpro对底物位点的切割效率,这可能有利于病毒复制酶复合体形成,促进病毒复制。 ***对小鼠IFN-β表达通路发挥负调控作用。PLpro能够改善病毒诱导的小鼠肺组织炎性损伤,抑制肺组织中IFN-β的表达水平。 研究结论: 本研究聚焦于SARS-CoV-2 PLpro的宿主相互作用分子发现及其机制研究,筛选出PLpro的相互作用分子DDX3/5,考察DDX3/5对PLpro酶活性及调控宿主天然免疫功能的影响,并在一定程度解析其机制,判断在病毒感染过程中PLpro可能与宿主Dead-box RNA解旋酶家族发生相互作用