关键词：
严重急性呼吸综合征冠状病毒2
非结构蛋白6
血管紧张素转化酶2
CD63
外泌体
PSMD12
摘要：
研究背景和目的:
自发现严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)以来,SARS-CoV-2在世界范围内迅速传播,并引发了2019冠状病毒病(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)的大流行。与人类历史上曾出现过的严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV)以及四种人类低致病性冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1)相比,SARS-CoV-2是一种传播速度更快、传播范围更广且突变更快的新型冠状病毒,严重威胁了人类生命健康、使国民经济和社会稳定遭受严重打击,给人类社会带来了前所未有的危机。SARS-CoV-2主要通过其刺突(Spike,S)蛋白与宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2)结合实现对宿主的入侵。S蛋白是新冠病毒感染宿主的重要蛋白,也是用于预防和治疗新冠病毒感染的单克隆抗体和疫苗研发的主要靶点。然而,随着病毒在流行期间的不断演化,促使其产生免疫逃逸能力,导致以S蛋白为靶点的部分疫苗和药物的效力下降。而无论S蛋白如何突变,ACE2仍是新冠病毒感染易感细胞的主要受体。以ACE2为靶点,抑制新冠病毒感染是一种有效的策略。研究发现新冠病毒感染后会产生大量富含ACE2的外泌体(ACE2-exos),ACE2-exos能够通过竞争性结合S蛋白阻断新冠病毒对宿主细胞的感染,而且能够有效对抗新冠病毒突变株。外泌体的低免疫原性、高生物相容性和先天装载能力,使得ACE2-exos在预防和治疗新冠病毒感染方面极具应用潜力。
病毒感染会导致外泌体的内容物、生成途径等发生变化,影响病毒致病性和机体免疫反应。ACE2-exos的表达和调控对于新冠病毒以及未来可能出现的其它冠状病毒的预防和控制至关重要。团队在前期研究中发现,干扰素能够上调宿主细胞外泌体中ACE2的蛋白水平,抑制新冠病毒进入宿主细胞。然而,在宿主细胞启动系列免疫反应抑制病毒感染的同时,病毒也在不断演化并发展出相应的策略逃避宿主免疫响应、促进自身侵袭。新冠病毒如何与宿主互作,是否参与调控宿主外泌体来源的免疫防御,这些问题仍亟待解决。
基于以上研究现状,本研究聚焦于ACE2-exos在新冠病毒感染中的作用,旨在探寻新冠病毒是否能够干扰宿主产生的外泌体防御,阐明病毒蛋白-宿主-外泌体之间的相互作用关系及病毒蛋白调控ACE2-exos促进病毒感染的潜在机制,为抗新冠病毒药物的研发提供新的策略。
研究方法:
本研究将编码新冠病毒各蛋白的质粒转染进HEK293T细胞中,初步筛选出NSP6可能影响外泌体的生成。随后通过流式细胞术、实时荧光定量PCR(QPCR)、western blot验证NSP6对外泌体形成关键蛋白CD63的影响。使用差速超高速离心法提取过表达NSP6的细胞产生的外泌体,通过western blot和纳米流式检测NSP6对外泌体的粒径、浓度及ACE2等蛋白表达的影响。使用慢病毒包装系统制备新冠假病毒,通过假病毒感染实验,研究CD63和NSP6对ACE2-exos抗病毒感染作用的影响。通过免疫荧光、免疫共沉淀等进一步研究新冠病毒蛋白与ACE2、CD63的相互作用和定位关系。
为了找出NSP6调控CD63和ACE2-exos的可能机制,本研究采用了免疫共沉淀联合质谱实验(Co IP-MS)以及si-RNA文库鉴定筛选潜在的关键宿主蛋白。通过免疫荧光、免疫共沉淀、假病毒感染实验、western blot和泛素化实验,验证了NSP6如何劫持宿主蛋白调控CD63及ACE2-exos的作用机制。
最后通过在新冠复制子系统中对NSP6的表达进行缺失或回补,进一步验证了NSP6在ACE2-exos介导的抗病毒感染中发挥的作用。
研究结果:
通过流式细胞术分析发现NSP6能够显著下调参与外泌体生成的关键蛋白CD63的平均荧光强度。QPCR结果显示,NSP6不影响CD63的m RNA水平。Western blot结果显示NSP6能够梯度下调HEK293T细胞以及肺上皮细胞A549和Calu-3中CD63的蛋白表达水平。通过纳米流式和western blot检测发现,NSP6能够抑制外泌体产生和外泌体上ACE2蛋白的表达。
通过假病毒感染实验验证了ACE2-exos对病毒感染的阻断作用,以及CD63能够增强A
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