关键词： 新型冠状病毒   芳香辟秽法   中药精油   ACE2   广藿香精油  

摘要： 背景:中医将新冠肺炎归属于“疫病”范畴,并以“芳香辟秽法”为指导,在临床中使用芳香类中药进行防治。现代药理学证明,精油是芳香类中药的重要有效成分。因此,验证中药精油作为“芳香辟秽法”的新剂型抗新冠病毒感染有效性,既是对中药抗新冠病毒机制的一种验证思路,也是对中药防疫应用新剂型的创新拓展。 目的:通过验证部分中药精油抗新冠病毒感染有效性,筛选出具有抗新冠病毒作用的中药精油,对精油抗病毒有效性进行初步药效机制研究。 方法:查询文献,以“芳香辟秽法”为指导原则,选择与新冠病毒相关性较高的10个精油,作为下一步实验使用。通过RT-qPCR实验,检测精油对ACE2蛋白及mTOR蛋白的影响,筛选出有抗病毒效果的精油。通过CCK-8实验进一步测定筛选出的精油对A549细胞活力影响,确定筛选出的精油最大安全量。使用带荧光素酶报告基因的新冠假病毒和Spike蛋白(以下简称S蛋白)与梯度浓度精油以及A549-ACE2细胞共同孵育,基于荧光显微镜观察病毒在细胞表面的定植与侵入情况,检测精油对细胞及ACE2与S蛋白之间的作用。 结果:RT-qPCR实验表明,苍术精油在48h时间组内ACE2蛋白表达量随浓度上升出现下降,在精油浓度为5%和10%的情况下,24h和48h两个时间组也出现了具有统计学意义的下降趋势;月桂叶精油在12h时间组内、青蒿精油在48h时间组内、广藿香精油在12、24和48h之间具备组间差异,以上均具有统计学意义(p<0.05)。各组精油中mTOR蛋白表达量无明显趋势变化,各时间组之间及各时间组内不同浓度下均未出现明显差异,且无统计学意义(p>0.05)。CCK-8实验表明广藿香精油在1%浓度下仍无细胞毒性,测得IC50值为13.57±2.41%。荧光素酶观察报告显示,与空白对照组相比,精油干预后病毒与细胞结合率明显下降,且随着精油浓度上升,病毒与细胞结合率逐步下降。 结论:柠檬、薰衣草、香榧、陈皮、丁香以及胡椒薄荷精油对ACE2蛋白转录水平无明显影响,苍术、青蒿精油对ACE2蛋白表达影响呈现时间依赖性,月桂叶精油则呈现出剂量依赖,广藿香精油在实验时间段内表现稳定,无明显偏向,具有较可靠的抗新冠病毒有效性,可对其进行进一步药效机制研究。广藿香精油对A549细胞活力及ACE2受体活性无明显影响,通过阻碍ACE2受体与S蛋白结合,减弱了病毒侵染力,降低了病毒与细胞结合率,对冠状病毒有一定的灭活作用。

关键词： 城市设施拥挤   建成环境   空间布局   新型冠状病毒感染   死亡风险  

摘要： 现代城市规划起源与城市空间应对城市卫生和健康问题密切相关，历次重大流行病爆发，都迫使城市规划进行空间规划探索与设计理念革新。因此，识别厘清新冠的空间传播机理和关键影响要素，成为学界关注的重要话题。目前研究聚焦城市密度，密度增加人群交往概率可能提供疫情传播基础，但高密度并不一定导致高发病率，人群聚集接触行为才是新冠扩散的直接原因。而城市设施是居民活动接触的重要空间载体，可作为量化人群聚集行为的空间对象，且不同类别设施对新冠传播的影响呈现出异质性。因此，本研究以香港1746个大型街区组（LSBG：Large Street Block Group）为空间单元，利用高斯型反向两步移动搜索法（Gai2SFCA：Gaussian Inverted Two-Step Floating Catchment Area Method）测度设施潜在拥挤度，基于病例数据量化感染死亡风险，探讨设施拥挤对新冠传播及致死的影响机制和深层逻辑，辩证审视城市紧凑发展对于传染病传播的影响。　　本研究首先评估感染死亡风险，以扩散质心、出行距离、扩散半径等探究其时空扩散模式。其次利用高斯型反向两步移动搜索法评估公服设施拥挤效应，按出行模式和时间扩展搜索半径，计算城市公园、综合医院、中小学在不同出行模式下的潜在拥挤度。最后以设施潜在拥挤度为解释变量，以感染死亡风险为结果变量，以建成环境、社会经济属性等为控制变量，构建线性回归、空间回归、结构方程模型，探究设施潜在拥挤度对感染死亡风险的影响机制。　　研究表明，第一，感染风险在时间周期上存在阶段性特征，感染死亡风险在空间上存在邻近扩散效应。感染风险在第三波疫情爆发时存在扩散质心突变，感染死亡风险都以整体扩散质心为中心，随距离先增加后减小。第二，设施潜在拥挤度及空间分布在不同出行模式及时间下存在差异。城市公园及中小学潜在拥挤度随出行范围增加而下降;综合医院在步行、公交模式下潜在拥挤度随出行时间增加提高，驾车十五分钟时接近服务饱和状态。第三，感染死亡风险存在双向中介效应，设施拥挤显著影响感染死亡风险。城市公园高潜在拥挤度导致低感染风险低死亡风险，可直接对死亡风险表现抑制效应，也通过降低感染风险抑制死亡风险;综合医院高潜在拥挤度导致高感染风险低死亡风险，以医院为中心存在邻近扩散，但救治危重患者抑制死亡风险;中小学高潜在拥挤度导致高感染风险低死亡风险，封闭而人口密集的校园易聚集感染，但学生群体不易发生新冠致死事件。本研究结论有利于指导城市设施合理布局，对于制定科学防疫政策具有实际意义，对后疫情时代健康韧性城市建设具有指导意义。

关键词： 即时检测   聚左旋多巴纳米颗粒   侧流免疫层析   新型冠状病毒   甲型流感病毒  

摘要： 2019年底新型冠状病毒肺炎席卷了全球,给人类社会造成了巨大的损失。在病毒感染的早期阶段,快速、准确地诊断严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是控制疫情传播的关键。SARS-CoV-2感染的早期症状(主要是咳嗽和发烧)与常见的呼吸道病毒相似,如甲型流感病毒(Flu A),这使得及时指导临床治疗比较困难。另一方面,Flu A的季节性流行也对人民健康造成了很大影响,早日诊断与及时的抗病毒药物治疗对于减轻症状和预防重症具有重要意义。因此,临床上迫切需要准确、快速地诊断Flu A和SARS-CoV-2的方法。 侧流免疫层析技术(LFIA)是即时检测(POCT)中的一种,主要依靠抗原抗体的特异性免疫反应,使得纳米标记材料能够在试纸上聚集显色,达到检测目标物的目的。目前市面上的免疫层析试纸大多以胶体金纳米颗粒为标记材料,但是应用胶体金的检测试纸大多存在灵敏度低、显色度低及背景脏等问题,同时胶体金纳米颗粒与捕获抗体的结合力为静电作用力,也存在结合不稳定等问题。这些不足导致胶体金检测试纸在一些特定情况下(如检测低浓度样品)可靠性不足,得不到准确的结果,限制了 LFIA在即时检测中的进一步发展。针对这种情况,一些新型的标记纳米材料被研发出来应用于试纸的制备,但是大多存在制备繁琐等缺点。因此,寻找一种新型的制备简单的纳米颗粒对推动LFIA的应用具有重大的意义。 本文利用一步合成法制备聚左旋多巴纳米颗粒(PLDA NPs),通过探究不同的反应条件(不同反应时间、原料配比、氧气含量)来达到制备粒径可控纳米颗粒的目的,并对PLDA NPs的保存条件及显色度进行了探究。将PLDA NPs作为标记材料应用于LFIA制备了新型冠状病毒检测试纸以及甲型流感病毒检测试纸。 (1)成功制备新型冠状病毒抗原检测试纸:探究了新型冠状病毒抗原特异性抗体与微球的偶联方法,通过对偶联pH值、抗体与PLDANPs偶联量以及NC膜检测线(T线)上多抗浓度的优化,制备了高信噪比和高灵敏度的新型冠状病毒抗原检测试纸。测试了试纸的最低检测浓度,并对同一批试纸以及不同批次试纸的变异系数(CV值)进行分析,得到了重复性好,灵敏度高的新冠抗原检测试纸,其最低检测限为5 pg/mL,比市售新型冠状病毒抗原检测试纸(胶体银法、乳胶法)的灵敏度更高。 (2)成功制备甲型流感抗原检测试纸:探究了甲型流感抗原特异性抗体与微球的偶联方法,通过对偶联pH值、抗体与PLDANPs偶联量以及NC膜T线上多抗浓度的优化,制备了高信噪比和高灵敏度的甲型流感抗原检测试纸。测试了试纸的最低检测浓度,并对同一批试纸以及不同批次试纸的变异系数进行分析,得到了重复性好,灵敏度高的甲型流感抗原检测试纸,其最低检测限为0.1 ng/mL,比市售甲型流感抗原检测试纸(胶体金法)的灵敏度更高。

关键词： 电脉冲   新型冠状病毒变异株   铁蛋白   DNA疫苗   免疫原性  

摘要： 由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)已经发展为全球大流行,严重危害人类生命健康。疫苗接种是预防和控制COVID-19疫情最有效的策略,但目前接种的大多数SARS-CoV-2疫苗是根据原始毒株设计的,针对变异株的保护效果有所下降,研发应对SARS-CoV-2变异株的疫苗已成为当务之急。DNA疫苗具有研发、生产周期短、易保存等优势,但由于诱导机体产生的免疫效果较差,阻碍了其在人类临床的应用。铁蛋白纳米颗粒具有稳定性高、安全性好、生物相容性高的特点,是一种理想的疫苗载体平台。因此,提高体内递送和表达效率成为DNA疫苗研究的重点方向。基于上述研究背景和研究现状,本研究开展了以下内容: 1、新型冠状病毒DNA疫苗递送系统的筛选 为提高DNA疫苗的体内免疫效果,本研究将表达SARS-CoV-2 Delta变异株S蛋白的重组DNA候选疫苗pSN-Delta-S使用肌肉注射(IM)联合电脉冲核酸药物导入系统(EP)免疫BALB/c小鼠。与IM的免疫方式相比,采用IM联合EP的免疫方式可降低4倍免疫剂量,且小鼠血清中针对S蛋白的特异性IgG抗体效价提高5倍以上。使用IM联合EP方式进行免疫,经筛选后,pSN-Delta-S重组质粒在BALB/c小鼠中的最佳免疫剂量为25μg,第一次免疫后间隔21天进行第二次免疫,小鼠血清中针对S蛋白的特异性IgG抗体效价最高。在金黄地鼠中的最佳免疫剂量也为25μg。免疫BALB/c和C57BL/6J小鼠后,两种品系的小鼠血清中针对S蛋白的特异性IgG抗体水平基本一致,无小鼠品系差异。为评价IM联合EP系统条件下,重组质粒在小鼠体内的表达效率和持续时间,构建了表达萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒pSN-Delta-S-Luc,采用IM联合EP免疫BALB/c小鼠后,24 h时开始表达Delta-S蛋白,随着时间的推移,荧光信号逐渐增强,第7天荧光信号最强,随后减弱,到21天荧光信号消失,单独IM免疫组未检测到荧光信号,表明IM联合EP免疫递送方式,较单独IM递送方式,重组DNA疫苗在小鼠中的表达效率、持续时间和免疫原性得到了明显的提高。 2、铁蛋白为基础的新型冠状病毒变异株DNA疫苗的构建及鉴定 为提高新冠DNA疫苗的免疫效果,本研究以铁蛋白为基础,SARS-CoV-2抗原基因分别选择全长S蛋白(S)、缺失胞内区和跨膜区的S蛋白(SΔTM)和缺失七肽重复序列2的S蛋白(SΔHR2),成功构建了3种SARS-CoV-2 Omicron-XBB变异株重组DNA疫苗(pSN-XBB-S-Fer、pSN-XBB-SΔTM-Fer和pSN-XBB-SΔHR2-Fer)。为进一步验证铁蛋白增强新冠DNA疫苗的通用性,使用相同方法,成功构建了3种SARS-CoV-2 Delta变异株重组DNA疫苗(pSN-Delta-S-Fer、pSN-Delta-SΔTM-Fer和pSN-Delta-SΔHR2-Fer)。将6种重组质粒转染至HEK293细胞中,经Western Blot方法验证,6种抗原均得到了很好的表达,条带单一,大小正确。针对上述6种重组质粒,进行重组质粒的实验室制备,经检验浓度和纯度均符合标准,可用于后续动物实验使用。 3、铁蛋白为基础的新冠变异株DNA疫苗的免疫评价 为评价以铁蛋白为基础的含S蛋白不同结构的Omicron-XBB变异株重组DNA疫苗在小鼠体内的免疫效果,分别免疫pSN-XBB-S-Fer、pSN-XBB-SΔTM-Fer和pSN-XBB-SΔHR2-Fer重组质粒。其中,pSN-XBB-SΔHR2-Fer重组质粒免疫组免疫效果最佳,2免后21天,针对S蛋白的特异性IgG抗体效价可达1:109 350,分别是pSN-XBB-S、pSN-XBB-S-Fer和pSN-XBB-SΔTM-Fer免疫组的2.3倍、3.7倍和1.7倍。胞内细胞因子IFN-γ的表达分别是pSN-XBB-S、pSN-XBB-S-Fer和pSN-XBB-SΔTM-Fer免疫组的2.26倍、1.48倍和1.28倍,胞内细胞因子IL-4的表达分别是pSN-XBB-S、pSN-XBB-S-Fer和pSN-XBB-SΔTM-Fer免疫组的2.84倍、1.45倍和1.26倍特异性IgG抗体亚型主要偏向于IgG2a,针对自身毒株Omicron-XBB变异株的中和抗体效价最高,对Omicron-BA.2变异株、Omicron-BA.5变异株和Omicron-EG5变异株下降较低,分别下降了2倍、2倍和6倍。对Omicron-BA.1变

关键词： 床旁超声   新型冠状病毒肺炎   器官灌注   液体容量状态  

摘要： 目的: 探讨床旁超声(Po CUS)评估新型冠状病毒(COVID-19)肺炎危重型患者心功能、血流动力学在预测COVID-19危重症患者死亡风险的价值。 方法: 我们选择了2022年12月17日至2023年7月30日在贵州医科大学附属医院重症监护病房收治的新冠肺炎危重症患者80例。排除掉肾移植及临床资料不完整的病人,最终纳入68例患者,根据患者出院后预后情况分为存活组31例和死亡组37例,患者入院后24小时内行床旁超声(Po CUS)检查。收集患者临床资料:性别(Sax)、年龄(Age)、身高(Height)、体重(Weight)、身体质量指数(BMI)、体表面积(BSA)、入院症状、血压(BP)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)、合并症、动脉血氧饱和度(Sa O2)、ICU住院天数、28天死亡率、患者24小时尿量(UV)、24小时总出量(IA)和24小时总入量(OA)。实验室指标:生化指标(心肌酶)、动脉血气分析、C-反应蛋白(CRP)、炎症因子等。床旁超声指标:双肾大小、脾脏大小、双侧肾动脉、脾动脉、肠系膜上动脉血流频谱指标。下腔静脉、肝静脉、门静脉、肠系膜上静脉血流频谱指标。左心和右心结构和功能超声指标。肺超声(LUS)评分以及超声静脉过负荷(VEx US)评分以及体循环阻力(SVR)和肺循环阻力(PVR)。 分析两组患者的Po CUS及实验室指标水平与预后的相关性,使用拟合回归和ROC分析各参数分别对患者死亡的预测能力以及Po CUS对新型冠状病毒肺炎危重型患者预后预测的价值。 结果: 68例危重症患者,死亡组37例(54.41%)、存活组31例(45.59%),两组人群间年龄、28天死亡率、Pco2、N-端脑利钠肽前体(NT-Pro BNP)、心肌肌钙蛋白T(c Tn T)、C-反应蛋白(CRP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、降钙素(PCT)、室间隔厚度(IVSd)、三尖瓣反流压差(TR-PGmax)、右心室中份横径(RV-m)、右心室舒张末面积左心室舒张末面积(RVEDA/LVEDA)死亡组大于存活组,而PH、平均动脉压、血氧饱和度、右肾动脉舒张末期血流速度(RRA-EDV)、左肾动脉舒张末期血流速度(LRA-EDV)、脾长径(Sp-L)、门静脉内径(DPV)、脾静脉舒张末期流速(SV-D)、左心室舒张末内径(LVDd)、二尖瓣侧壁瓣环舒张早期血流速度(e′-mv(lateral))死亡组小于存活组,下腔静脉塌陷率(IVC-CI)死亡组的大部分<50%,差异均有具有统计学意义(P<0.05)。 单因素Logistic回归初步筛选出影响因素后继续多因素Logistic回归分析,结果显示:平均动脉压、CRP、CK-MB、LRA-EDV、RRA-EDV、LVDd、DPV、SV-D、RV-m是危重症患者死亡的独立预测因子,CRP、CK-MB、RV-m增高将增加患者的死亡风险,平均动脉压、LRR-EDV、RRA-EDV、LVDd、DPV、SV-D、降低将增加患者的死亡风险;受试者工作曲线(ROC曲线)显示:平均动脉压、CRP、CK-MB、RRA-EDV、LRA-EDV、LVDd、DPV、SV-D评估COVID-19患者预后的曲线下面积分别为0.613、0.854、0.675、0.714、0.648、0.638、0.693、0.666,预测值分别为87.5mm Hg、54.58mg/L、24.51U/L、12.45cm/s、6.975cm/s、43.2mm、9.9mm、10.55cm/s,对于其预测准确性最好。 结论: 床旁超声可用于帮助描述新型冠状病毒肺炎危重型患者的血流动力学情况,识别患者器官灌注情况。

关键词： 新型冠状病毒   生鲜食品   微滴式数字PCR   精准定量   食品安全  

摘要： 新冠疫情爆发以来,国内外发生了多起冷链生鲜食品及外包装检出新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）核酸阳性事件,SARS-CoV-2随生鲜食品传播扩散的风险与食品中病毒污染量、病毒活性、病毒变异等因素相关。开展生鲜食品SARS-CoV-2污染量检测,结合病毒基因组测序,建立精准高效的定量检测技术,综合评估病毒传播风险,为阻断SARS-CoV-2随生鲜食品的传播,提高食品卫生安全具有重要意义。本研究基于微滴式数字PCR（Droplet digital PCR,ddPCR）技术,开发可同时鉴别SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因的四重检测方法,为生鲜食品中SARS-CoV-2的污染检测及传播风险监测提供重要技术支撑。主要研究结果如下: 1.根据SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因保守性基因片段分别设计多组引物与探针,并基于保守性基因片段构建对应阳性质粒,经PCR扩增、凝胶电泳及测序鉴定。结果显示,4组引物探针均能有效扩增目的基因序列,通过NCBI比对与SARS-CoV-2对应片段的序列同源性达到98%以上。 2.基于ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因引物探针序列,建立多重荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR detecting system,qPCR）方法,优化退火温度及引物探针配比浓度,验证特异性、灵敏度、重复性效果。结果显示,多重qPCR方法检测ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因的最低检测下限分别为37.03 copies/μL、36.93 copies/μL、48.28 copies/μL、46.92 copies/μL,灵敏度检测结果线性拟合R2≥0.998,该方法线性相关性好。 3.在qPCR方法的基础上,构建多重ddPCR方法,优化退火温度及引物探针配比浓度,确定其检测范围。结果显示,多重ddPCR方法检测ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因的最低检测下限分别为0.59 copies/μL、0.68 copies/μL、1.44 copies/μL、1.03 copies/μL,该方法特异性强、灵敏度更精确,可实现对生鲜样品中SARS-CoV-2的绝对定量检测,检测效果优于多重qPCR检测方法。 4.对生鲜食品进行病毒RNA提取,最终确定基于磁珠法的核酸提取方法仅需15 min便可高效率完成对病毒核酸的提取。采用建立的多重qPCR方法和多重ddPCR方法对人工污染样品及抽检样品进行检测。结果显示,人工污染样品检出率为100%,270份抽检样品未检出SARS-CoV-2。