关键词： 糖尿病肾脏疾病   新型冠状病毒感染   队列研究  

摘要： 目的 本研究旨在通过随访合并新型冠状病毒感染(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)的糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)患者出院后一年的健康状况,从而探究COVID-19对DKD患者临床特征的长期影响,为更多其他种类的呼吸系统传染病合并DKD的干预和调护提供参考价值。 方法 本研究选取2022年12月至2023年3月期间成都中医药大学附属医院住院部的1432例DKD(不包括慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)G5期)的患者,将是否感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)作为暴露因素,分为暴露组与非暴露组。对其行长达12个月随访,约每3个月随访一次,收集指标:血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿微量白蛋白/肌酐(urinary albumin to creatinine ratio,UACR)、尿酸(uric acid,UA)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,Hb A1c)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、复查期间复阳率、呼吸系统感染性疾病发病率、中医证候积分量表。 结果 1.本研究最终纳入统计583例患者,暴露组504例,非暴露组79例。 2.纳入各组患者在入院期间各项指标基线水平、中医证候积分均无显著差异性(P<0.05),具有组间可比性。 3.在DKD人群中,高龄、较长的DKD病程等因素更容易感染SARS-Co V-2,住院时间与是否感染SARS-Co V-2、不同的中医证型之间具有相关性。 4.从短期来看,COVID-19对DKD患者的Scr、UACR、UA、Hb A1c、TC、TG有消极影响,与未罹患COVID-19的同期患者相比,中医证候积分降低具有统计学差异(P<0.05)。 5.从中长期来看,COVID-19可对Scr产生长期不可逆的消极影响,COVID-19对的UACR、UA、Hb A1c、TC、TG持续影响逐渐减弱,相应指标可恢复至未罹患COVID-19的患者的同期水平。COVID-19对不同中医证型的患者所产生的影响存在差异。 6.暴露组会出现普遍的复阳现象,较非暴露组有更高的风险患有其他呼吸系统传染性疾病。 研究结论 高龄、更长的DKD病程是COVID-19易感性的危险因素,合并COVID-19后会使得DKD患者住院时间延长。短期来看,COVID-19对DKD患者的中医症候改善、肾功能水平、糖脂代谢稳定有消极影响,从中长期来看,COVID-19对糖脂代谢稳定影响逐渐减弱,但对肾功能水平、部分证型的症候改善有持续性消极影响。感染SARS-Co V-2后有更高的复阳风险和患有其他呼吸系统传染性疾病。

关键词： 慢性乙型肝炎轻度   新冠疫苗   安全性   新型冠状病毒感染  

摘要： 目的　　探讨慢性乙型肝炎（CHB）轻度患者接种新冠疫苗的安全性和有效性及其新型冠状病毒感染的临床特征。　　方法　　回顾性分析从2021年5月至2023年1月至南昌大学第二附属医院就诊的CHB轻度患者接种新冠疫苗前后肝功能、血常规等生化指标变化、副作用、新冠抗体的应答反应及其新型冠状病毒感染的临床特征。　　结果　　1.113例CHB轻度患者接种新冠疫苗后的生化指标变化及副作用结果显示：与接种新冠疫苗前相比，CHB轻度患者接种新冠疫苗后101例肝功能指标稳定（89.30%），6例AST、ALT轻度升高（5.3%），3例AST和ALT2倍升高（2.7%），1例AST和ALT3倍升高（0.9%），1例TBil轻度升高（0.9%）和1例ALB轻度下降（0.9%）;血常规指标无明显变化107例（94.7%），2例NEUT%和NEUT#轻度下降（1.8%），2例NEUT%轻度升高（1.8%），1例WBC、NEUT%和NEUT#轻度下降（0.9%）和1例EO%轻度下降（0.9%）;细胞因子未见异常6例（46.2%），5例IL-6明显下降（38.5%），2例IL-6明显升高（15.4%）;27例出现副作用（23.9%），其中注射部位肌肉酸痛17例（15.0%）;乏力2例（1.8%）;头痛、头晕2例（1.8%）;瘀斑1例（0.9%）;发热1例（0.9%），流涕1例（0.9%）;双侧膝关节疼痛伴乏力1例（0.9%）;舌头麻痹1例（0.9%）;左手关节疼痛1例（0.9%）。　　***轻度患者接种新冠疫苗后产生新冠抗体应答反应结果显示：CHB组新冠抗体阳性率（60.0%）高于非CHB组（56.1%），但差异均无统计学意义（P=0.584）。CHB组中新冠抗体阳性患者年龄低于新冠抗体阴性（37.2±10.2vs38.8±10.0岁），男性新冠阳性率（54.9%）高于女性（45.1%），差异均无统计学意义。HBeAg阴性新冠抗体阳性率（52.9%）高于HBeAg阳性（47.1%），HBVDNA阴性新冠抗体阳性率（66.7%）高于HBVDNA阳性（33.3%），但差异均无统计学意义。CHB组治疗方式中Peg-IFN/IFN组25例（49.0%），ETV组16例（31.4%），TDF/TAF组6例（11.8%），未抗病毒组（护肝治疗）4例（7.8%），各组间差异无统计学意义（P=0.553）。　　***轻度患者新型冠状病毒感染的临床特征分析结果显示：与非CHB组相比，基线特征显示CHB组感染新型冠状病毒年龄更高（（38.6±11.5vs32.7±15.7）岁，Plt;0.001），且以男性（57.80%）感染居多（P=0.003），差异均具有统计学意义。临床表现显示CHB组出现发热概率更低（74.90%vs89.70%，Plt;0.001），且体温峰值更低（（38.0±1.0vs38.4±0.8℃,Plt;0.001），差异均具有统计学意义，畏寒、寒战、喉咙痛、咳嗽、咳痰等症状均无统计学意义（Pgt;0.05）。临床分型显示CHB组(86.20%)与非CHB组(92.40%)均以轻型为主，CHB组无症状（11.30%)概率高于非CHB组(4.50%)，且需药物治疗率（53.20%）低于非CHB组（76.40%），差异均具有统计学意义（Plt;0.05），住院率（2.40%）低于非CHB组（3.00%），但无统计学意义（P=0.647）。　　结论　　***轻度患者无论是抗病毒治疗或未抗病毒治疗期间接种新冠疫苗的安全性良好。　　***轻度患者接种新冠疫苗后能产生与正常人相同的抗体应答反应，且不受年龄、性别、HBeAg阴性或阳性、HBVDNA阴性或阳性及治疗方式的影响。　　***轻度患者抗病毒治疗期间新型冠状病毒感染的临床症状与非CHB组相比相对较轻。

关键词： 新型冠状病毒   狂犬病病毒   口服疫苗   肌注式灭活疫苗   水貂  

摘要： 新型冠状病毒感染（COVID-19）是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的人兽共患病,流行范围广,传播速度快,对人类健康和公共卫生安全造成极大的影响。SARS-CoV-2易感动物范围广泛,包括多种伴侣动物、养殖经济动物以及野生动物。在自然环境中,SARS-CoV-2可通过暴露接触造成动物间、动物与人之间的传播感染。动物COVID-19疫苗的研发和应用是降低和阻断动物SARS-CoV-2感染和传播的有效手段。因此,需要研制安全、有效的动物用COVID-19疫苗,以降低SARS-CoV-2在动物之间以及动物与人之间的传播风险。 SARS-CoV-2的刺突蛋白（Spike protein,S）可与宿主细胞受体结合,是诱导宿主免疫反应以对抗SARS-CoV-2感染的主要结构蛋白,广泛应用于疫苗开发中的靶标抗原。野生型S蛋白构象不稳定,易水解成S1和S2蛋白,免疫原性较差。为提高S蛋白稳定性、表达量和免疫原性,本研究以SARS-CoV-2野生株（WT）、Delta和Omicron BA.2流行株的S蛋白基因为骨架,进行Furin裂解位点突变、6个脯氨酸突变（F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P）、t PA信号肽基因替换等分子修饰,人工合成了基因S6P、DS6P、BA2S6P作为候选免疫原基因。 本研究团队前期将狂犬病病毒（rabies virus,RABV）ERA株的糖蛋白G进行R333E突变获得分子修饰候选口服疫苗株rERAG333E,可作为优秀的疫苗载体开发重组二联疫苗。本研究将S6P、DS6P、BA2S6P基因插入rERAG333E的P和M基因之间,构建了重组病毒rERAG333E/S6P、rERAG333E/DS6P、rERAG333E/BA2S6P。重组病毒体外感染试验结果显示,S6P、DS6P、BA2S6P均可分别稳定、高效表达预融合的S蛋白,并且不影响重组病毒的体外生长性状。重组RABVs作为口服疫苗分别单独或联合免疫BALB/c小鼠,体重变化与载体疫苗免疫组相比无显著差异,并能诱导产生高水平的SARS-CoV-2中和抗体、WT/Delta/Omicron BA.2交叉中和抗体反应、唾液s Ig A反应及RABV中和抗体反应;作为肌注式灭活疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,同样显示出优秀的安全性和免疫原性。此外,rERAG333E/S6P作为口服、肌注式灭活疫苗在BALB/c小鼠上均具有良好的SARS-CoV-2攻毒保护效力,可有效阻止SARS-CoV-2在BALB/c小鼠上、下呼吸道的复制。 为评估重组RABVs作为新冠易感动物新冠疫苗的潜力,本研究将重组RABVs作为口服疫苗或肌注式灭活疫苗单独或联合免疫水貂,监测期内水貂均健活,且具有良好的免疫原性,联合免疫可诱导高效的SARS-CoV-2 WT/Delta/Omicron BA.2株交叉中和抗体反应及RABV中和抗体反应。水貂攻毒保护和传播阻断试验结果显示,rERAG333E/S6P作为口服、肌注式灭活疫苗在水貂上均具有良好的SARS-CoV-2 WT株攻毒保护和传播阻断效果,可有效降低SARS-CoV-2对水貂的感染、肺脏损伤和传播。 本研究结果表明,表达SARS-CoV-2修饰S蛋白的重组RABVs可作为口服疫苗候选株应用于流浪动物、野生动物等,作为肌注式灭活疫苗候选株应用于伴侣动物;联合免疫的免疫策略有潜力成为抵抗多种SARS-CoV-2流行株的动物用COVID-19多价疫苗;借助RABV灭活疫苗的成熟生产工艺,有潜力作为人用COVID-19和狂犬病二联候选疫苗株。

关键词： 新冠肺炎   趋近化   对比分析   新闻报道  

摘要： 国内外主流媒体对于新冠肺炎事件进行大量的报道。为探究在不同背景下对该事件报道的表述和认知的异同,本文基于趋近化理论中的STA模型,自建小型语料库,对《人民日报》和《纽约时报》自2019年12月至2022年12日,针对中国新冠疫情的英文报道进行定量和定性分析。主要尝试回答三个问题:(1)《人民日报》和《纽约时报》在报道中国新冠肺炎疫情中所使用的空间趋近化策略有何差异?其原因是什么?(2)《人民日报》和《纽约时报》在报道中国新冠肺炎疫情中所使用的时间趋近化策略有何差异?其原因是什么?(3)《人民日报》和《纽约时报》在报道中国新冠肺炎疫情中所使用的价值趋近化策略有何差异?其原因是什么? 研究发现:(1)中美媒体都采用了空间、时间、价值趋近化策略。中国媒体运用了更多的空间趋近化和价值趋近化话语策略,而美方运用了更多的时间趋近化策略。(2)在时间趋近化方面,《纽约时报》运用更多时间趋近化策略来强调新冠疫情和中国政府在过去、现在和将来三个时间维度上对话语空间内部阵营的威胁,目的是实现其取消中国政府抗疫政策合法化的政治意图。在空间趋近化上,中方的话语空间内部实体更广泛,不仅包括国家、政府、民众、医疗机构、医务人员、病人,还包括世界卫生组织和其他国家。在价值趋近方面,中方存在价值趋近策略明显多于美方,积极价值构建出中国一直在尽全力遏制疫情发展,肩负着保护人民群众生命健康安全的大国形象,一直秉持合作的态度;始终与世界卫生组织保持交流,与其他国家共同抗击疫情、共克时艰。(3)中方意在展示中国政府的积极态度和对战胜疫情的强烈期盼,而美方意在抹黑中国政府的形象,增加受众对中国政府的负面抵抗情绪。 基于语料库的方法,本研究从趋近化理论视角进行话语分析,可以拓宽语料库语言学的研究视野。在现实意义上,本文可以启发新闻从业者更客观公正的报道,提高读者辩证性阅读意识以及培养我们感知语言用意的敏感性。

关键词： 污水流行病   新型冠状病毒   城市污水   基因测序   变异  

摘要： 目的 了解贵阳市2023年2—12月污水中新型冠状病毒（SARS-CoV-2）含量和基因变异情况。方法 采用荧光定量PCR方法完成了1 034份污水样本的ORF1ab基因和N基因浓度的检出，使用Illumina测序平台完成病毒全基因组测序。结果 在收集到的1 034份样本中，检测出587份SARS-CoV-2阳性样本，ORF1ab基因浓度中位数为3.69拷贝/ml,N基因浓度中位数为7.57拷贝/ml，污水中SARS-CoV-2的浓度与医疗机构报告病例数之间存在相关性。对5份Ct<32的SARS-CoV-2阳性样本利用测序平台完成了全基因组测序，平均覆盖度在63.91%～97.28%之间，病毒分型均为奥密克戎亚分支，共鉴定出110个突变位点，S蛋白共鉴定出22个氨基酸的改变，其中包括关键突变E484A。结论贵阳市城市污水中新型冠状病毒检出率较高，病毒浓度与临床病例具有良好相关性，应用全基因组测序技术，检测污水中病毒遗传物质的变异株组成情况，并鉴别出多个变异位点，通过对城市污水病毒监测，能有效地对疾病的时空趋势进行把握，是临床检测的重要补充，为地方政府实施精确疫情防控政策提供参考。

关键词： 性传播疾病   预测   时间卷积网络   新型冠状病毒感染疫情   非药物干预措施  

摘要： 目的:性传播疾病（Sexually Transmitted Diseases,STDs）是当今影响人类最严重、最广泛的传染病之一。性传播疾病在全球范围内流行,严重威胁着人类的生命和健康。随着新型冠状病毒感染（Novel Coronavirus Disease 19,COVID-19）疫情的流行,中国性传播疾病的传播也受到了相应的影响。本研究利用时间卷积网络（Temporal Convolutional Networks,TCN）模型预测2020年未受COVID-19疫情流行影响的中国法定报告性传播疾病（艾滋病、梅毒和淋病）的发病情况,对比实际发病情况,进行定量评估并探讨COVID-19疫情及其非药物干预措施（Non-pharmaceutical Interventions,NPIs）对性传播疾病流行的影响。 方法:以中国地区2004年1月至2018年12月的艾滋病、梅毒和淋病月度报告发病数据为训练集,构建自回归综合移动平均（Autoregressive Integrated Moving Average,ARIMA）、长短期记忆（Long Short-Term Memory,LSTM）和TCN模型。以2019年1月至12月的数据作为验证集,检验模型的预测效果。采用均方根误差（Root Mean Squared Error,RMSE）和平均绝对误差（Mean Absolute Error,MAE）来评价三个模型的拟合精度和预测精度。采用预测精度最高的模型对2020年1月至12月的三种性传播疾病数据进行预测,然后计算出每种疾病2020年每个月实际报告发病人数与预测报告发病人数之间的绝对百分比误差（Absolute Percentage Error,APE）值。最后,每种疾病的APE值与COVID-19的非药物干预措施评价指标和COVID-19的每月报告发病人数进行Spearman相关性分析,分析它们对性传播疾病流行的影响。 结果:艾滋病和梅毒的报告发病人数呈逐年上升趋势,淋病的报告发病人数呈先降后升趋势。在训练集和验证集上,TCN模型的RMSE值和MAE值都是最低的,能较好的拟合和预测艾滋病、梅毒和淋病的数据,可以用来预测2020年这三种性传播疾病的发病情况。COVID-19的非药物干预措施指标和COVID-19的每月报告发病人数,在2020年2月都出现了最大值。然而,三种性传播疾病的APE值在该月出现了最小值,随后恢复到正常水平。相关分析显示,艾滋病APE值与COVID-19报告发病人数（rs=-0.594,P<0.05）具有相关性;淋病APE值与COVID-19报告发病人数（rs=-0.601,P<0.05）、学校封闭管理（rs=-0.762,P<0.01）、关闭工作场所（rs=-0.748,P<0.01）、限制公共活动（rs=-0.748,P<0.01）,限制聚集（rs=-0.748,P<0.01）,限制交通工具（rs=-0.594,P<0.05）,居家要求（rs=-0.601,P<0.05）和限制国内流动（rs=-0.760,P<0.01）具有相关性。 结论:与传统的时间序列ARIMA和LSTM模型相比,TCN模型具有更高的预测精度,它更适用于中国艾滋病、梅毒和淋病的时间序列预测。此外,在2020年,中国政府遏制新型冠状病毒感染流行的非药物干预措施对于降低淋病发病有显著影响,但是随着NPIs的放宽,三种疾病的发病情况也随之恢复到正常水平。这对今后开展性传播疾病预防和控制工作具有一定的借鉴意义。

关键词： Omicron   RBD   免疫原性   细胞因子  

摘要： 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2),是一种新出现的单股正链RNA病毒,属于β属冠状病毒,该病毒比SARS和MERS更具有传染性,对人有易感性,主要引发急性呼吸道传染病,以发热、干咳、腹泻为主要表现,重症患者伴随着咳血、昏死、窒息等严重症状,最终导致机体器官衰竭死亡。目前,Omicron变异株是新冠病毒的主要流行毒株,在全世界范围内造成感染人数激增,一度对公共医疗资源的分配和疫情防控造成很大压力。研究表明,新冠病毒S蛋白受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)通过与人血管紧张素转化酶2受体(human Angiotensin-Converting Enzyme 2,hACE2)识别,介导新冠病毒S蛋白与hACE2结合,从而增强病毒的感染和传播能力。因此,阻断RBD与hACE2的识别是抑制新冠病毒感染宿主细胞的有效策略之一。 本研究以Omicron变异株RBD蛋白为研究对象。实验前期,通过生物信息学的方法对RBD蛋白的理化性质、B细胞抗原表位和空间结构等方面进行预测和对比,结果发现,不同变异株RBD蛋白理化性质、B细胞抗原表位等变化明显,为研究不同变异株RBD蛋白生物学功能提供理论依据。为深入研究RBD蛋白的功能,我们成功构建了pET-28a-BF.7-RBD、pET-28a-BF.7-RBD dimer(二聚体)原核表达载体以及pCAGGS-HA-BF.7-RBD、pCAGGS-HA-BF.7-RBD dimer(二聚体)真核表达载体。将原核表达质粒转入到*** BL21感受态细胞中,使用IPTG诱导目的蛋白表达,利用SDS-PAGE和Western Blotting检测到RBD蛋白能够在*** BL21中进行诱导表达。通过单因素分析法和响应面分析法探索RBD蛋白的最佳表达条件并进行大量表达。结果表明,BA.1 RBD蛋白在37℃、IPTG浓度为0.73 m M诱导表达13.5 h时可获得最大表达量;同理得到,BF.7 RBD蛋白在26.00℃,IPTG浓度1.26 m M诱导表达12.00 h;BF.7 RBD dimer蛋白在29℃,IPTG浓度1.0m M诱导表达10 h可获得最大表达量。 使用Ni柱进行亲和层析纯化,将纯化的RBD蛋白多次免疫C57BL/6J小鼠,定期采集小鼠血清,通过ELISA试验检测BF.7 RBD dimer免疫小鼠的抗体效价可达1:409600,BA.1 RBD蛋白和BF.7 RBD蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体效价均为1:204800,但均低于BF.7 RBD dimer免疫小鼠血清的抗体效价,表明RBD dimer具有免疫原增强功能。使用IFA和Western blotting方法对制备的多克隆抗体反应性进行检测,结果表明,多克隆抗体均可识别大肠杆菌和HEK-293T细胞表达的RBD蛋白,表明大肠杆菌表达的RBD蛋白具有强烈的免疫原性。将免疫后的C57BL/6J小鼠取脾获得脾细胞,使用RBD蛋白对脾细胞进行体外刺激,通过间接ELISA和Real-time q PCR方法从表达和转录水平对小鼠脾脏细胞中IL-4、IFN-γ进行检测。结果表明,RBD蛋白可以能够诱导小鼠产生IFN-γ,但是未检测到IL-4的明显变化,表明RBD蛋白诱导小鼠通过Th1途径产生细胞免疫,Th2途径需要进一步检验。最后,我们评估了疫苗血清对RBD蛋白的结合活性。使用LFD方法对血清进行筛选后得到阳性血清和阴性血清,通过间接ELISA和Western blotting的方法检测血清对RBD蛋白的结合活性。结果表明,疫苗血清和商业化Omicron RBD抗体均可识别RBD蛋白,并且疫苗血清对BF.7 RBD和BF.7 RBD dimer蛋白的结合活性降低。 综上所述,创新点在原核表达系统制备的BF.7 RBD蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫,制备的多克隆抗体具有识别不同系统表达RBD蛋白的能力,同时大肠杆菌表达的RBD蛋白可以被疫苗血清识别。表明大肠杆菌表达系统制备的BF.7 RBD蛋白具有开发为诊断试剂的潜在价值。

关键词： 单环碱基C-核苷类化合物   RNA依赖性RNA聚合酶   新型冠状病毒   傅克反应   设计   合成  

摘要： 新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）所引起的新型冠状病毒肺炎疫情（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）,自2019年12月12日武汉首位新型冠状病毒肺炎病患发病以来,在全球范围内迅速蔓延开来,并且对人类的生命健康造成了严重威胁。SARS-CoV-2感染通常会导致流感样症状,如咳嗽、发烧、喉咙痛、头痛、背痛、味觉丧失或嗅觉丧失等。截至2023年10月,全球已有超过7711万例COVID-19确诊病例,超过696万例COVID-19相关死亡病例。 在已报道的SARS-CoV-2的14个已知分子靶点中,血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme,ACE2）、RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）、木瓜蛋白酶样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)和主蛋白酶(Main protease,Mpro)受到广泛关注。核苷类药物在抗病毒和抗癌等化学治疗中有着广泛应用。与传统的N-核苷相比,C-核苷的特点是存在C-C糖苷键,使C-核苷类化合物具有更强的耐化学和酶水解性,因其不易被分解,从而在体内保持较长时间的活性。其中,单环碱基C-核苷类化合物具有结构稳定性,这种结构特征赋予了其在药物代谢过程中的优势,从而使其在药物化学领域具有应用潜力。 本文通过文献阅读并且参考含有糖苷结构的活性化合物的分子结构以及过往的药物研发经验,以噻唑福林（Tiazofurin）的结构作为主要参考,以Friedel-Crafts反应为关键步骤,实现了糖环和碱基的直接C-C偶联,以此构建了核心的C-核苷类母核,随后通过取代反应、偶联反应、Click反应等引入了结构多样并含有多个氢键给体和氢键受体的碱基结构,对碱基片段进行结构修饰,共得到了41个结构多样的单环碱基C-核苷类化合物。随后针对构建的小型分子化合物库,进行了细胞水平的抗病毒活性评价,未发现活性化合物。 综上所述,COVID-19的大流行对公众健康造成严重威胁。核苷类药物在抗SARS-CoV-2的化学治疗中有着广泛应用。其中,单环碱基C-核苷类化合物具有结构稳定性,在药物代谢过程中显示出的优势,使其在药物化学领域具有应用潜力。本文旨在以具有抗病毒活性的C-核苷类化合物的结构作为参考,开发简单通用的单环碱基C-核苷类化合物的合成方法,进一步拓展C-核苷类化合物的结构多样性,以推动未来抗病毒药物的研发工作。本文虽未筛选出具有抗新型冠状病毒活性的化合物,但为后续设计并合成具有抗病毒活性作用的化合物提供了参考和借鉴。

关键词： 新型冠状病毒   细胞融合   新冠感染合胞体   衰老相关分泌表型   SNAI1  

摘要： 2019年以来,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的肺炎疫情在全球范围内广泛流行,对全球的公共卫生体系造成严重威胁。近年以来,尽管我们对新冠病毒的结构、入侵机制、致病特点和治疗手段的研究逐渐深入,但在当前与病毒共存的大背景下,新冠肺炎的广泛流行、变异毒株的不断进化仍然给我们的日常防护和临床治疗带来严峻挑战,新冠病毒引发的重症感染以及一些后遗症仍旧对患者生命健康和生活质量造成威胁。 新冠重症感染的显著特征之一是肺部存在明显的由细胞融合形成的合胞体。合胞体的形成又被称作合胞体化,融合在一起的细胞最终产生多核巨细胞,其大小从几个到几十个细胞不等。研究表明新冠病毒感染引起的肺部合胞体的数量和体积是决定患者病情严重程度的关键。早期流行的重症率较高的Alpha、Beta和Delta等毒株显示出了较原始毒株更强的合胞体形成能力,而重症率较低的Omicron毒株造成细胞融合的能力则明显降低,这是合胞体形成与感染严重程度呈现正相关关系的直接证明。 新型冠状病毒介导产生的合胞体,主要依赖于新型冠状病毒表面刺突蛋白与宿主细胞表面ACE2受体之间的相互作用。S蛋白S1亚基的受体结合区负责识别宿主细胞表面ACE2受体,从而完成病毒与细胞结合的过程,而S2亚基则负责将病毒外包膜与人类细胞膜进行融合,从而实现病毒入侵的全过程。入侵的病毒则利用宿主细胞器完成生命周期并合成新病毒释放到周围环境,新合成的S蛋白继续与邻近细胞膜上的ACE2受体结合并使多个细胞融合,促使合胞体的形成。 虽然目前已有报道的研究结果表明,由新冠病毒S蛋白介导产生的融合细胞能够发生凋亡或者焦亡,但我们前期实验中发现部分合胞体能够长期存活,利用β-半乳糖苷酶染色研究发现这部分存活的合胞体发生了细胞衰老。本课题在发现和表征新冠病毒感染的合胞体发生衰老现象的基础上,对决定合胞体命运的分子机制进行深入研究。 1、建立4种新冠融合细胞系模型和融合程度定量方法 通过慢病毒包装和感染技术在细胞中分别过表达S和ACE2,成功构建了4种SARS-2-S融合细胞系模型(A549/293FT/He La/HIEC-6)。利用互补Lac Z原理建立了细胞融合程度的定量方法,比较了多种新冠病毒S蛋白突变体的致细胞融合能力。 2、新冠病毒S蛋白介导产生的合胞体出现衰老表型 利用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色对共培养不同时间的合胞体衰老情况进行观察并分析,结果表明存活的新冠感染合胞体衰老染色结果阳性,提示这部分存活的新冠感染合胞体发生了细胞衰老;进一步研究发现,BPTES、Fisetin和Venetoclax等具有抗衰老潜力的抑制剂可显著抑制衰老合胞体的存活。 3、通过转录组测序发现多种衰老标志基因在合胞体表达水平上升 研究发现新冠病毒感染引起的合胞体细胞形成在早期和晚期均伴随着多种关键基因的显著上调和下调,其中经典细胞衰老标志基因CDKN1A随融合程度显著上调,而细胞增殖标志基因MKI67则显著下调,IL6、IL8、MMP3和MMP9等衰老相关分泌因子均显著上调。 4、衰老的合胞体加重心力衰竭 研究发现新冠假病毒感染的小鼠,其心脏射血分数明显下降,心衰指标上调明显,心肌细胞损伤,炎症指标上调,表明衰老的心肌细胞合胞体促使炎症因子释放增加,最终导致心力衰竭。 5、TNF信号通路促进合胞体细胞走向衰老而非死亡 针对4 h和48 h的合胞体细胞转录组学数据分析的结果表明,融合时与细胞存活显著相关的信号通路TNFα-TNFR2及其下游关键效应蛋白显著升高,抑制该通路的下游关键信号分子c IAP2后会导致合胞体细胞的损伤,而增加TNFα信号的表达会促进合胞体细胞走向衰老,表明TNF信号通路在合胞体细胞衰老命运中发挥关键作用。 6、SNAI1是调控合胞体衰老命运的关键靶标 转录组学数据结果显示,SNAI1的表达随着融合程度的增加而上调,提示其在合胞体的形成和衰老过程中发挥重要作用。而抑制SNAI1的表达或功能后,合胞体的存活率和衰老率显著降低,表明SNAI1是抑制合胞体存活和衰老的关键靶标。 综上所述,本研究发现并表征了新冠感染合胞体的衰老命运,并发现了TNFα-TNFR2通路和SNAI1是调控合胞体命运的关键靶点,抑制TNFR2和SNAI1能够有效干预合胞体的衰老命运,研究成果为降低新冠患者重症率和减轻减少新冠后遗症提供了新的思路。