关键词:
严重急性呼吸综合征冠状病毒2
包膜蛋白
USP39
去泛素化酶
摘要:
尽管世界卫生组织宣布新冠肺炎(COVID-19)大流行已经结束,但严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染仍然是一个重大的公共卫生挑战。SARS-CoV-2变异株不断涌现,可能会长期威胁人类健康。该病毒粒子由四种结构蛋白组成,其中包膜(Envelope,E)蛋白序列在不同病毒变体中具有高度保守性,对病毒组装、出芽和致病至关重要。E蛋白单独即可驱动过度活跃的细胞因子风暴,使其成为治疗COVID-19的潜在作用靶点。微生物学家将SARS-CoV-2视为专性细胞内寄生物,即它需要依赖宿主细胞才能实现自我复制。宿主的细胞环境可以被病毒精心利用,包括翻译后修饰(Post translation modifications,PTMs)等一整套机制。SARS-CoV-2入侵宿主细胞的蛋白组学和修饰组学是冠状病毒病研究领域的前沿热点,蛋白及修饰维度的研究有助于解析病毒与宿主之间的作用机制。PTMs已被证明是病毒与宿主相互作用的关键分子事件,密切调节着病毒蛋白的结构和功能。特别是病毒蛋白的翻译后修饰,如泛素化修饰,在病毒复制中起着重要作用,该过程由E3泛素连接酶与去泛素化酶动态调控。基于本课题组前期研究,已经发现E3连接酶RNF5介导E蛋白产生K48链多泛素化,使其经泛素-蛋白酶体系统降解。然而,目前还不清楚E蛋白产生K48链的多泛素化过程,具体被宿主的哪一种去泛素化酶所逆转。去泛素化酶USP39属于泛素特异性蛋白酶家族成员之一,参与多种细胞生物学过程,尤其能够抑制多种底物蛋白的多泛素化。本研究利用免疫共沉淀联合质谱分析筛选并确定了USP39作为宿主的去泛素化酶,能够特异性与E蛋白相互作用并降低其K48链多泛素化水平,进而减少其降解。综合运用生物化学与分子生物学手段,我们深入研究了USP39促进SARS-CoV-2复制的作用机制。本研究深化了我们对SARS-CoV-2蛋白与宿主之间相互作用的了解,为形成以调控E蛋白泛素化为核心的冠状病毒病防治新策略,奠定了理论基础。
方法:1、筛选并验证USP39能否抑制E蛋白K48链多泛素化并减少其降解:利用质谱分析鉴定哪些蛋白质与泛素化E蛋白相互作用,利用生物信息学方法分析哪些蛋白质参与泛素化修饰;在HEK293T细胞中,我们将候选去泛素化酶(USP14-Myc或USP39-Myc)分别与E-HA共转染,进行免疫印迹检测E-HA的表达水平;设计体内和体外去泛素化实验,进行免疫印迹检测E-HA的泛素化水平;在HEK293T细胞中,用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)处理细胞,当外转USP39-Myc或敲低内源性USP39时,进行免疫印迹分析E-HA的表达水平以检测对衰减速率的影响。2、验证USP39与E蛋白是否特异性相互作用:利用免疫荧光共聚焦技术验证共定位;进行免疫共沉淀验证相互作用;利用荧光共振能量转移实验进一步验证。3、探索USP39抑制E蛋白K48链多泛素化的分子机制:分别共转染USP39-Myc及其截短突变体与E-HA进行免疫印迹,免疫共沉淀以确定相互作用结构域。4、验证USP39是否通过稳定E蛋白并驱动过度活跃的细胞因子风暴:在HEK293T细胞中,分别设计过表达和敲低USP39的实验,利用免疫印迹检测E蛋白表达水平和RT-q PCR检测细胞内相关炎性因子m RNA水平。5、验证USP39促进新冠病毒复制的功能:用SARS-CoV-2感染不同细胞系,检测内源性USP39蛋白表达水平和m RNA水平;用SARS-CoV-2感染稳转USP39或敲低USP39细胞,检测病毒蛋白表达水平、基因m RNA水平和病毒滴度。6、验证E蛋白是USP39促进SARS-CoV-2复制的特异性靶点:USP39-Myc与其他泛素化新冠病毒蛋白共转染,检测病毒蛋白表达水平;在RNF5敲除和不敲除的细胞系中转染si-USP39,检测病毒蛋白表达水平、m RNA水平和病毒滴度。
结果:1、USP39可显著抑制新冠病毒E蛋白K48链多泛素化并减少其降解:(1)从KEGG数据库和GO富集方面对质谱分析结果进行筛选,确定除了E3连接酶RNF5外,去泛素化酶USP14和USP39也与E蛋白共沉淀;(2)与USP39-Myc共转染组E-HA蛋白表达水平与MG132效果相当均高于对照组以及与USP14-Myc共转染组;在体内和体外去泛素化实验中均可以看到泛素化E蛋白与USP39共孵育组,其多泛素化水平低于与USP14共孵育组;(3)与对照组相比,与USP39-Myc共转染时E-HA的衰减率降低,而敲低内源性USP39后E-HA的衰减率增加;(4)在HEK293T细胞中共转染E-HA和UbK48-Flag,当敲低内源性USP39