关键词:
植物乳杆菌
新型冠状病毒
滴鼻免疫
黏膜疫苗
摘要:
自2019年12月首次发现新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2,SARS-CoV-2)感染以来,其毒株一直在持续变异,包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron变异株。其中Omicron与其他变异株相比突变最多,包括50个整体突变和26-32个刺突(Spike,S)蛋白的突变。Omicron谱系S蛋白的突变导致传染性增强,且易于逃避恢复期血浆、单克隆抗体和疫苗血清的中和作用。S蛋白由S1和S2两个亚单位组成,S1包含N端和C端结构域。受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)位于N端结构域,负责与血管紧张素转酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2)受体结合,拥有多数中和表位。N端结构域通过与宿主的酪氨酸蛋白激酶受体相互作用参与病毒感染,而C端结构域为ATP和核酸的新型结合域。因此,S1蛋白被认为是疫苗设计的理想蛋白。另外,乳酸菌作为一种共生菌,对体内环境具有抵抗力,具备高粘附性,有助于在肠道和呼吸道中定植。由于其佐剂和免疫调节特性,乳酸菌是将疫苗抗原输送至黏膜以预防和治疗疾病的理想载体。
本研究以Omicron变异株(B.1.1.529)的S1蛋白为抗原靶位,利用植物乳杆菌表达系统构建了两株表达S1蛋白的重组植物乳杆菌。根据Omicron S1(B.1.1.529)氨基酸序列,在上下游分别添加了XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点、内源信号肽1320、树突状细胞靶向肽(Dentritic Cell Targeting Peptides,DCpep)和HA表位标签,经密码子优化后进行合成。以合成质粒为模板,PCR扩增目标片段并将其命名为OS1。利用无缝克隆将OS1片段连接到线性化的p SIP411载体中,获得重组质粒p411-OS1。通过电转化将目标质粒p411-OS1转入乳酸球菌NZ3900中,筛选出阳性菌落,进行菌落PCR验证。将测序正确的质粒电转入植物乳杆菌LP18与LP12中,筛选阳性菌落并进行PCR鉴定,分别命名为rLP18:OS1和rLP12:OS1。上述结果表明,本研究成功构建了两株含Omicron S1的重组植物乳杆菌rLP18:OS1和rLP12:OS1。
收集rLP18:OS1和rLP12:OS1,破碎后提取蛋白,通过Western Blot、间接免疫荧光、流式细胞术检测目的基因的表达情况。试验结果表明,Omicron S1基因在rLP18:OS1和rLP12:OS1中均可有效表达,流式结果显示,rLP18:OS1和rLP12:OS1的阳性率分别为13.38%和75.77%。为了提高目的蛋白的表达量,对重组植物乳杆菌表达条件(诱导温度,诱导时间和诱导剂浓度)进行优化。rLP18:OS1和rLP12:OS1在30℃温度,Spp IP浓度为100 ng/m L时诱导12 h条件下目的蛋白表达量最高。为了评估rLP18:OS1和rLP12:OS1中Omicron S1蛋白的表达量,首先在最优条件下诱导重组植物乳杆菌,并提取总蛋白,并测定总蛋白浓度。通过Western Blot印迹评估样本中的Omicron S1蛋白表达水平。通过测定不同浓度的Omicron RBD蛋白Western Blot灰度值,建立标准曲线和回归方程,计算出Omicron S1蛋白的表达量。结果显示,10~9CFU的rLP18:OS1和rLP12:OS1中分别含有约2.27μg和1.52μg目的蛋白。根据蛋白表达结果,本研究选择重组植物乳杆菌rLP18:OS1进行了后续试验。
为了评价重组植物乳杆菌的免疫原性,本研究将BALB/c小鼠分为三组(PBS,rLP18:Vector,rLP18:OS1组),通过滴鼻免疫途径,在第-4、-2、0 d免疫10~8CFU/20μL重组植物乳杆菌,并在第10、12、14 d加强免疫。采集血液,鼻灌洗液,肺灌洗液,肠黏膜溶液进行ELISA检测,流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞分化水平,派氏结节中抗原提呈细胞激活情况。结果显示,rLP18:OS1组的IgG水平明显高于PBS组。免疫后21 d,rLP18:OS1组粪便中的IgA显著高于对照组。21 d和35 d的肺泡灌洗液和肠黏膜溶液以及鼻腔灌洗液中的IgA含量均明显增加,CD4+T,CD8+T细胞亚群显著增加,第35 d,CD11c+CD86+细胞的比例也显著增加。这些结果表明rLP18:OS1刺激小鼠机体产生体液免疫应答,并且促进T细胞分化,抗原提呈细胞的激活。
本研究进一步在金黄地鼠中进行了免疫攻毒保护性评价。将对金黄地鼠分为三组(PBS,rLP18:Vector和rLP18:OS1组),在第-4、-2和