关键词： 双苄基四氢异喹啉生物碱   尖刺碱   衍生物   新型冠状病毒  

摘要： 新冠病毒感染导致的疫情威胁人类生命健康和社会经济发展。新冠病毒在持续变异,抗新冠病毒药物研发仍具有重要意义。在前期工作基础上,本论文以双苄基四氢异喹啉生物碱类化合物尖刺碱作为先导结构,设计、合成了尖刺碱衍生物18个,以期获得具有抗新冠病毒活性强、细胞毒性弱、安全指数高、并且具有良好的药物代谢动力学性质的抗新冠病毒候选化合物。 依据前期构效关系研究和文献调研分析结果,我们认为尖刺碱的细胞毒性很可能是酚羟基引起的。因此,我们首先围绕尖刺碱的酚羟基位点进行结构改造。对酚羟基进行官能团转化,合成了13个新化合物;在酚羟基邻位引入硝基,随后还原及关环得到4个新化合物;酚羟基酯化得到1个衍生物。活性测试结果表明,上述18个尖刺碱类化合物的抗新冠病毒活性与尖刺碱相比均有提高,其中化合物B10的抗新冠病毒活性EC50=0.53μM(尖刺碱的这一活性数据为EC50=21.3μM)。对其中15个化合物在Vero E6细胞上进行了毒性测试,发现4个化合物的细胞毒性有所降低,其中化合物B4的细胞毒性测试结果为CC50=66.7μM(尖刺碱的这一毒性数据为CC50=33.6μM)。 在已合成的尖刺碱衍生物中,对具有较强抗新冠病毒活性和较低细胞毒性的化合物B1、B4、B5开展了初步药物代谢动力学性质,以及急性毒性和亚急性毒性实验。药代动力学研究结果表明,化合物B1在小鼠体内的药代动力学性质得到明显改善。化合物B1同尖刺碱相比口服给药暴露量(Cmax=854±76 ng/m L,AUC=12770±1428h*ng/m L)提高了2倍到6倍,在小鼠体内的半衰期(T1/2=12.54±2.49 h)增长,口服生物利用度（F=77.4%）提高。这些结果表明化合物B1具有进一步研究价值。

关键词： 新型冠状病毒   埃博拉病毒   土贝母苷   ACE2   NPC1  

摘要： 新冠病毒(SARS-CoV-2)和埃博拉病毒(EBOV)均为严重威胁全球公共卫生安全的人兽共患病原,分属冠状病毒科和丝状病毒科成员。埃博拉病毒是世界上致病力最强的病毒之一,一旦感染,其致死率可高达90%。2019年底爆发的新型冠状病毒感染,短短几个月时间内,在全球迅速蔓延开来,截止到2023年9月,全球共有770,562,703例人感染新冠病毒报道。新冠病毒的快速变异给疫苗的有效性带来巨大挑战,埃博拉疫情的突发性及流行特点严重妨碍疫苗预防的可及性,这些都凸现抗病毒药的重要性。迄今已有抗冠状病毒和丝状病毒的药物推向应用,但主要靶向病毒感染周期中后期功能分子,如转录或翻译后加工。研发靶向病毒复制周期不同阶段的“鸡尾酒”抗病毒药物,可显著提高抗病毒效应,同时降低耐药突变导致药物脱靶的几率。本项目利用基于免疫缺陷病毒HIV-1骨架,表达luciferase的假病毒感染系统(HIV-1-Luc),从来源植物成份的小分子化合物药物库中筛选在早期阶段抗病毒感染的小分子化合物。首先,我们构建表达EBOV GP蛋白的假病毒(HIV-1-Luc/EBOV-GP)感染系统,以表达免疫缺陷病毒HIV-1囊膜蛋白的假病毒(HIV-1-Luc/HIV-1-Env)和水泡性口炎病毒囊膜蛋白的假病毒(HIV-1-Luc/VSV-G)为对照,从含有974种来源于植物的小分子化合物药库中筛选具有特异性抗EBOV感染的化合物。利用以上筛选系统,本研究初步筛选出19种具有潜在抗EBOV感染的化合物;接下来,本研究继续对初筛的19种化合物的抗病毒效应进行验证,细胞实验结果表明,19种小分子化合物中,5种化合物具有更好的抗EBOV感染活性,分别为Toremifene(Tor)、Tamoxifen(Tam)和Tubeimosides I、II、III(Tub I、II、III),其中,Tor和Tam已经被报道过具有抵抗EBOV感染的功能。生物信息学预测表明Tub I、II、III可通过直接靶向EBOV入侵受体NPC1抑制其感染。NPC1定位于内体-溶酶体系统,作为丝状病毒在内体中的受体介导其在内体中的膜融合和复制。根据文献报道,结合生物信息学分析表明NPC1蛋白对SARS-CoV-2入侵起到重要作用,进一步细胞实验证明,Tubeimosides处理的细胞具有明显抵抗SARS-CoV-2感染的效应,推测NPC1可能为SARS-CoV-2内体中的入侵受体。接下来,我们用免疫共沉淀、ELISA实验证明SARS-CoV-2 spike蛋白可直接与NPC1互作,并且Tubeimosides可直接封闭spike蛋白与NPC1结合。在以上实验结果基础上,为验证NPC1在SARS-CoV-2病毒入侵细胞中的作用,我们用SARS-CoV-2假病毒系统和真毒株分别感染野生型和NPC1缺失的细胞,结果表明,与野生型细胞相比,SARS-CoV-2假病毒感染NPC1缺失的细胞,其luc活性下降至少100倍;SARS-CoV-2真毒株感染NPC1缺失的细胞,其病毒载量明显下降,尤其是肺泡细胞系A549NPC1缺失的细胞系,几乎检测不到感染性病毒粒子,以上结果证明NPC1作为SARS-CoV-2内体中受体介导其入侵,Tubeimosides可通过直接靶向NPC1封闭其与SARS-CoV-2和EBOV囊膜蛋白结合抑制感染。为验证Tubeimosides通过靶向NPC1抑制冠状病毒和丝状病毒感染是否具有普遍性,本研究利用免疫共沉淀实验、假病毒感染NPC1缺失细胞实验继续研究NPC1蛋白在SARS-CoV-2变异株、SARS-CoV-1、和MERS-CoV等病毒感染中的功能,结果表明NPC1蛋白也是SARS-CoV-2变异株、SARS-CoV-1、和MERS-CoV等丝状病毒感染所必需的,Tubeimosides可通过封闭病毒表面囊膜蛋白与NPC1互作抑制其感染。综上所述,本研究结果证明SARS-CoV-2病毒通过内吞途径入侵细胞时,内体中的NPC1蛋白作为其受体介导病毒囊膜与内体膜的融合,从而启动病毒粒子的复制;Tub I、II、III可通过靶向NPC1抑制新冠病毒和丝状病毒的感染。本研究结果揭示NPC1作为膜融合受体介导新冠病毒和丝状病毒入侵细胞的新机制,发现Tubeimoside可特异靶向NPC1分子,有效抑制新冠病毒和泛丝状病毒复制,表明Tubeimoside具有靶向新冠病毒和泛丝状病毒复制早期阶段抗病毒药物的开发潜力。本研究不仅为冠状病毒入侵细胞的机制提供了理论基础,也为开发抗新冠病毒和泛丝状病毒感染药物提供了靶点。

关键词： 新媒体   新冠肺炎疫情   负面情绪   舆论治理  

摘要： 在众多公共卫生事件中，2020年初发生的新冠肺炎疫情有其特殊性。作为一种全新的流行病，其强传染性使得疫情迅速波及全国乃至全球。在国内严格的疫情防控下，公众一方面要防范病毒感染，另一方面也要承受长期封控在家的困扰。借助互联网这一新媒体平台，公众的信息获取打破了传统媒体的垄断，但媒体上的情感分享也会导致情绪传染，构建出一个承载各群体和情感需求的舆论场。相较于正面情绪，公众更愿意将积压的负面情绪在社交媒体上释放，从而导致群体情绪的极化，这不仅严重影响个人的心理健康，甚至令社会长期笼罩在负面情绪的阴霾之下，导致超越事件本身不可控舆论危机的产生。本文从负面情绪出发，借助社会网络分析，情感分析等研究方法，对新冠疫情封控中的文本话语进行深度挖掘，以期勾勒出新冠肺炎中的公众话语，追踪其负面情绪的流动过程，并尝试为负面情绪的治理提出建设性意见。　　研究主要发现如下：其一，新冠肺炎期间负面情绪长期保持在较高强度，但积极性的框架使得负面情绪更多地被“遮蔽”，公众情绪的两极分化明显，“好”和“恶”成为最为显著的情绪，其他次要情感则面临消逝。其二，社交媒体中“恶”的情绪出现泛化趋势。对新冠肺炎疫情的讨论偏离了事实本身，对新冠病毒的防治，对正常生活的渴望，对新疆火灾的惋惜都逐渐脱离事件本身，演变为社会矛盾和民族矛盾。对事实的探究逐渐演变为情感和立场之争，并随各新媒体事件波及开来。其三，不同性别对于负面情绪的传染具有不同的特性。相较于女性，男性具有更强的负面情感知觉能力，特别是对特定话题更加敏感。而女性则在负面情绪的接收和传播上更具有优势，能够接收到更早发布的情感信息，所表达情感持续时间也更长时间。其四，数字化的社交媒体是传统媒体在数字空间权力的延伸。传统媒体的社交媒体账号凭借其线下积累的优势加剧了话语权的集中，但即便如此，普通用户也可以通过在社交媒体上制造情感爆点来获得话语主导权。　　通过追溯负面情绪传染的过程，本文针对性的提出了以下三点舆论治理策略：加强心理健康服务，推动负面情绪的合理释放;针对情绪传染过程中不同性别的优势来进行情感引导;更加注重情感领袖的培养，特别是加强与演艺人员的合作。

关键词： 新型冠状病毒   病毒排泌   病毒嗜性   宏转录组测序   单细胞分析  

摘要： 新型冠状病毒感染(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)是一种由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染机体导致的急性上呼吸道传染病。COVID-19发病快,起病急,具有极高的传染性,并且具有潜在的多组织器官嗜性。尽管包括中国在内的许多国家放松了对于SARS-CoV-2的管控政策,但是新的变异株仍在不断出现,对疾病易感人群带来了复发感染的风险。因此,了解SARS-CoV-2对于人体各组织器官的嗜性以及病毒在患者呼吸道的病毒排泌(Viral shedding)模式和规律对于COVID-19的防控和临床治疗具有非常重要的意义和价值。 本研究主要聚焦于研究SARS-CoV-2在COVID-19患者呼吸道的病毒排泌特征以及规律。该问题对于了解COVID-19患者的排毒周期以及精准制订对于SARS-CoV-2的管控策略来说至关重要,但是受限于现有技术,目前缺乏研究该问题的手段和技术策略。传统的病毒RNA测定方法仅局限于定量,而不是剖析病毒的排泌模式。病毒载量(Viral load)作为衡量病毒排泌丰度的金标准,仅定量病毒的基因组片段而不能代表传染性病毒粒子的存在。定制的病毒颗粒分析方法如电子显微镜(Electron Microscopy,EM)或空斑试验(Plaque-formingassays)能够提供令人信服的证据,但是这些方法成本高昂且需要高等级的生物安全实验室,难以应用于大队列样本。因此,我们迫切需要基于大型队列开发新技术,以了解SARS-CoV-2的排泌模式。在此,我们整合了人类SARS-CoV-2宏基因组数据,并开发了一种名为RedeCoronaVS的新算法,以单细胞数据为参考,系统分析了 SARS-CoV-2的排泌模式。我们认为可以通过三种方式检测人呼吸道中的SARS-CoV-2:在靶细胞内活跃复制的病毒(病毒复制子)、完成生命周期后释放的游离病毒(病毒颗粒)和无活性的病毒片段(病毒片段)。 我们发现,SARS-CoV-2颗粒是感染早期(住院后≤24小时)病毒排泌的主要方式。在住院后第1周内,宿主细胞内的SARS-CoV-2复制子与病毒颗粒一起主导SARS-CoV-2排泌。1周后,轻、中度患者以病毒片段为主,但部分重度患者仍以病毒复制子为主。除上皮细胞外,中性粒细胞、巨噬细胞和浆细胞中的SARS-CoV-2复制子也发挥了重要作用,并与采样时间和疾病严重程度相关。总之,以上工作为SARS-CoV-2的基础研究提供了新的思路与见解,也为病毒的防控与治疗提供了理论依据。

关键词： 新冠肺炎   涉华报道   独联体   国家形象   一带一路  

摘要： 自世界卫生组织(WHO)于2020年1月21日发布第一份疫情公告后,新冠疫情逐步成为影响全球的国际突发性公共卫生事件,其影响范围之深、覆盖范围之广,引发中外媒体高度关注,这些媒体尤其聚焦中国在疫情中的表现。作为“一带一路”倡议的重要链路——独立国家联合体(下文称独联体),也对中国的疫情进行大规模报道。研究独联体区域涉华疫情报道,有助于我们管窥与中国紧密联系的独联体区域对中国的看法和态度,把握在当下日益复杂的国际舆论环境中,作为关系紧密却又存在内部差异的独联体区域建构的中国国家形象,揭露隐含在报道背后的权利关系和意识形态。 本文以“一带一路”沿线国家独联体区域的涉华疫情报道为研究对象,在Factiva中收集相关报道文本,通过分层抽样和系统抽样的方式明确样本833个。以臧国仁三层次框架理论为支撑,结合内容分析法和文本分析法,从高、中、低三层结构揭示报道主题,剖析将中国疫情发展现状转化为媒介现实的方法。在此基础上,讨论涉华疫情报道采用的具体框架,并分析在报道中呈现的中国国家形象,以及建构国家形象时使用的策略与成因。 研究发现,在独联体区域涉华疫情报道文本与话语中涵盖了中国政治、经济、社会、科技多个主题,通过书写这些主题,报道对中国疫情不仅进行了多方面的介绍,而且强调了中国与独联体区域之间的深层关联。此外,报道采用了冲突对抗框架、人文关怀框架、责任归因框架,在文化霸权与东方主义的影响下,通过选择与舍弃新闻来源、凸显与隐藏报道主旨,建构了多样化的中国国家形象。

关键词： 新型冠状病毒   后遗症   德尔塔   助阳补肺除痹颗粒   疲劳评估量表(FAS)  

摘要： 目的:通过横断面研究调查COVID-19(Delta)患者出院2年后的情况。并通过临床研究初步观察助阳补肺除痹颗粒治疗COVID-19后遗症(肺肾阳虚证)的临床疗效,以期为治疗此证提供理论依据。 方法:1横断面研究通过电话随访调查COVID-19(Delta)患者的健康状况,对调查结果进行统计学分析。 2中医疗效初步观察针对COVID-19后遗症(肺肾阳虚证)的患者,给予助阳补肺除痹颗粒口服,疗程30天,对所得结果进行统计分析和探讨性研究。 结果:1横断面研究共随访成功129例,存在后遗症的患者共64例(49.6%)。报告最多的后遗症是疲劳/乏力(26.4%)。有后遗症的患者年龄更大,他们出院后再次感染的比例也更高(P<0.05)。不足45岁的患者报告疲劳/乏力的最多,而45岁及以上患者身体疼痛的情况最多。感染SARS-Co V-2(Delta)时临床分型为重症和危重症的患者相比于其他患者出现更多的呼吸困难、便秘等情况,也出现更多血糖水平升高的情况以及脑血管疾病事件。 2临床研究纳入的25例患者在试验过程中脱落6例,最终有19例患者纳入分析,所有患者均完成问卷评估,其中中医证候积分提示受试者乏力、畏寒、四肢冰冷积分低于治疗前(P<0.05),中医证候积分总分低于治疗前(P<0.05),治疗总有效率52.63%。欧洲生命质量学会的健康状况视觉模拟评分(EQ-VAS)在治疗后提高(P<0.05)。肺一氧化碳弥散量及其占预计值的百分比和6分钟步行距离占预计值百分比高于治疗前(P<0.05)。全部患者的胸部CT结果中可见最多异常为肺结节,有11例(57.89%)。 结论:1 COVID-19(Delta)患者出院2年的横断面研究结论 1.1 COVID-19(Delta)患者出院2年后,有49.6%的患者存在后遗症。 1.2年龄和住院期间应用糖皮质激素与COVID-19(Delta)后遗症的发生有关。最常见的后遗症是疲劳/乏力,其次是身体疼痛,且身体疼痛多见于45岁及以上人群。 2 COVID-19后遗症(肺肾阳虚证)中医疗效初步观察结论 助阳补肺除痹颗粒能够减轻COVID-19后遗症(肺肾阳虚证)患者的临床症状,增强心肺功能,提高生活质量。

关键词： 新型冠状病毒   Omicron变异株   母儿结局   胎盘  

摘要： 背景 新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)至今已衍生出包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron多种变异株。其中,世界卫生组织公布Omicron为第5个值得关注的变异株。2022年12月7日我国宣布全面放开新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)疫情管控,感染人数激增。中国疾病预防控制中心官网显示,2022年9月26日至2023年4月20日全国报送的本土病例SARS-CoV-2基因组有效序列均为Omicron。孕妇感染SARS-CoV-2可能会增加妊娠不良结局的风险,危及母儿的生命健康安全。Omicron作为新出现的SARS-CoV-2变异株以及我国疫情管控全面放开后的主要流行株,有必要评估其对孕产妇和新生儿的影响。而胎盘作为影响母儿结局的关键环节,对胎盘进行转录组学特征分析可为研究Omicron对母儿结局的影响提供理论依据。基于此,本研究结合临床资料分析和转录组测序手段,全面探讨妊娠期感染SARS-CoV-2变异株Omicron对母儿结局的影响。 目的 探讨妊娠期感染SARS-CoV-2变异株Omicron对母儿结局的影响,对了解Omicron在妊娠期间的生物学行为、预防和制定类似SARS-CoV-2感染的产科管理有着重要的意义。方法 1.妊娠期感染Omicron与不良母儿结局的相关性:选择2022年11月至2023年1月感染SARS-CoV-2并在广东省妇幼保健院产科分娩的176名孕妇作为感染组,同时,选取同期无SARS-CoV-2感染的584名产妇作为对照组。比较2组孕妇的一般资料、孕妇的不良结局及围生儿的不良结局。 2.妊娠不同时期感染Omicron的母儿结局及新生儿产后42天随访:选择2022年11月20日至2023年1月25日感染SARS-CoV-2并后续在广东省妇幼保健院产科行剖宫产分娩的330例孕妇为研究对象。按感染的孕周进行分组,其中,孕早期组(<14周)80例,孕中期组(14～27+6周)151例,孕晚期组(≥28周)99例。比较3组孕妇的一般资料、妊娠合并症、妊娠并发症、妊娠结局及新生儿产后42天随访的情况。 ***感染孕妇胎盘组织的转录组测序分析:利用转录组测序技术探究SARS-CoV-2变异株Omicron急性感染(感染组)、感染恢复(恢复组)、无感染(正常组)孕妇胎盘组织(各7例)的转录组水平,筛选差异表达基因。并进一步采用q RT-PCR比较感染组、正常组的差异表达基因和宿主抗病毒效应基因IFITM3、促炎细胞因子IL-6、肿瘤坏死因子TNF的表达水平,评估孕妇胎盘的转录组水平变化及有无炎症反应或抗病毒反应,以期从转录组水平上分析Omicron感染对母儿结局的影响。 结果 1.妊娠期Omicron感染与不良母儿结局的相关性:感染组和对照组妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病(Gestational diebetes mellitus,GDM)、妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)、羊水量异常、胎盘早剥、早产、剖宫产、产后出血、内科重症监护病房(Medical intensive care unit,MICU)转入率及胎儿窒息、巨大儿、低出生体重儿、出生缺陷、胎儿死亡、新生儿高胆红素血症、新生儿低血糖、新生儿肺炎、新生儿重症监护病房(Neonatal intensive care unit,NICU)的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。感染组胎膜早破发生率低于对照组,羊水污染发生率高于对照组,(P<0.05),但大多数为羊水Ⅰ度污染,与Omicron感染无显著关联。 2.妊娠不同时期感染Omicron的母儿结局及新生儿产后42天随访:3组孕妇SARS-CoV-2感染的临床分型为轻症。孕早期组和孕晚期组GDM发生率高于孕中期组,孕中期组胎膜早破发生率高于孕晚期组(P<0.05)。3组孕妇胎盘早剥、胎儿窘迫、羊水污染、早产、产后出血、巨大儿、低出生体重儿发生率及MICU转入率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组新生儿出生体重、窒息率、NICU转入率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组新生儿急性上呼吸道感染、肺炎、消化系统疾病、心血管系统疾病发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。大多数新生儿的结局及产后42天随访情况良好。 ***感染孕妇胎盘组织的转录组测序分析:感染组、恢复组、正常组孕妇胎盘组织的转录组水平相当,无差异表达基因。放宽差异表达基因的筛选标准为P<0.01且差异倍数(Fold change,FC

关键词： 严重急性呼吸综合征冠状病毒2   包膜蛋白   USP39   去泛素化酶  

摘要： 尽管世界卫生组织宣布新冠肺炎(COVID-19)大流行已经结束,但严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染仍然是一个重大的公共卫生挑战。SARS-CoV-2变异株不断涌现,可能会长期威胁人类健康。该病毒粒子由四种结构蛋白组成,其中包膜(Envelope,E)蛋白序列在不同病毒变体中具有高度保守性,对病毒组装、出芽和致病至关重要。E蛋白单独即可驱动过度活跃的细胞因子风暴,使其成为治疗COVID-19的潜在作用靶点。微生物学家将SARS-CoV-2视为专性细胞内寄生物,即它需要依赖宿主细胞才能实现自我复制。宿主的细胞环境可以被病毒精心利用,包括翻译后修饰(Post translation modifications,PTMs)等一整套机制。SARS-CoV-2入侵宿主细胞的蛋白组学和修饰组学是冠状病毒病研究领域的前沿热点,蛋白及修饰维度的研究有助于解析病毒与宿主之间的作用机制。PTMs已被证明是病毒与宿主相互作用的关键分子事件,密切调节着病毒蛋白的结构和功能。特别是病毒蛋白的翻译后修饰,如泛素化修饰,在病毒复制中起着重要作用,该过程由E3泛素连接酶与去泛素化酶动态调控。基于本课题组前期研究,已经发现E3连接酶RNF5介导E蛋白产生K48链多泛素化,使其经泛素-蛋白酶体系统降解。然而,目前还不清楚E蛋白产生K48链的多泛素化过程,具体被宿主的哪一种去泛素化酶所逆转。去泛素化酶USP39属于泛素特异性蛋白酶家族成员之一,参与多种细胞生物学过程,尤其能够抑制多种底物蛋白的多泛素化。本研究利用免疫共沉淀联合质谱分析筛选并确定了USP39作为宿主的去泛素化酶,能够特异性与E蛋白相互作用并降低其K48链多泛素化水平,进而减少其降解。综合运用生物化学与分子生物学手段,我们深入研究了USP39促进SARS-CoV-2复制的作用机制。本研究深化了我们对SARS-CoV-2蛋白与宿主之间相互作用的了解,为形成以调控E蛋白泛素化为核心的冠状病毒病防治新策略,奠定了理论基础。 方法:1、筛选并验证USP39能否抑制E蛋白K48链多泛素化并减少其降解:利用质谱分析鉴定哪些蛋白质与泛素化E蛋白相互作用,利用生物信息学方法分析哪些蛋白质参与泛素化修饰;在HEK293T细胞中,我们将候选去泛素化酶(USP14-Myc或USP39-Myc)分别与E-HA共转染,进行免疫印迹检测E-HA的表达水平;设计体内和体外去泛素化实验,进行免疫印迹检测E-HA的泛素化水平;在HEK293T细胞中,用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)处理细胞,当外转USP39-Myc或敲低内源性USP39时,进行免疫印迹分析E-HA的表达水平以检测对衰减速率的影响。2、验证USP39与E蛋白是否特异性相互作用:利用免疫荧光共聚焦技术验证共定位;进行免疫共沉淀验证相互作用;利用荧光共振能量转移实验进一步验证。3、探索USP39抑制E蛋白K48链多泛素化的分子机制:分别共转染USP39-Myc及其截短突变体与E-HA进行免疫印迹,免疫共沉淀以确定相互作用结构域。4、验证USP39是否通过稳定E蛋白并驱动过度活跃的细胞因子风暴:在HEK293T细胞中,分别设计过表达和敲低USP39的实验,利用免疫印迹检测E蛋白表达水平和RT-q PCR检测细胞内相关炎性因子m RNA水平。5、验证USP39促进新冠病毒复制的功能:用SARS-CoV-2感染不同细胞系,检测内源性USP39蛋白表达水平和m RNA水平;用SARS-CoV-2感染稳转USP39或敲低USP39细胞,检测病毒蛋白表达水平、基因m RNA水平和病毒滴度。6、验证E蛋白是USP39促进SARS-CoV-2复制的特异性靶点:USP39-Myc与其他泛素化新冠病毒蛋白共转染,检测病毒蛋白表达水平;在RNF5敲除和不敲除的细胞系中转染si-USP39,检测病毒蛋白表达水平、m RNA水平和病毒滴度。 结果:1、USP39可显著抑制新冠病毒E蛋白K48链多泛素化并减少其降解:(1)从KEGG数据库和GO富集方面对质谱分析结果进行筛选,确定除了E3连接酶RNF5外,去泛素化酶USP14和USP39也与E蛋白共沉淀;(2)与USP39-Myc共转染组E-HA蛋白表达水平与MG132效果相当均高于对照组以及与USP14-Myc共转染组;在体内和体外去泛素化实验中均可以看到泛素化E蛋白与USP39共孵育组,其多泛素化水平低于与USP14共孵育组;(3)与对照组相比,与USP39-Myc共转染时E-HA的衰减率降低,而敲低内源性USP39后E-HA的衰减率增加;(4)在HEK293T细胞中共转染E-HA和UbK48-Flag,当敲低内源性USP39

关键词： 新型冠状病毒   结合亲和力   S蛋白突变体   机器学习   高通量筛选  

摘要： 自2019年底开始,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在全球范围内引发了大规模的流行性疫情。SARS-CoV-2的刺突(Spike,S)蛋白在受体识别和与宿主细胞结合等过程中扮演着重要的角色,其与宿主细胞受体的结合亲和力是病毒传播的重要驱动力。在传播过程中,SARS-CoV-2在S蛋白上出现了许多组合性突变。尽管目前已经对SARS-CoV-2及其变体进行了大量研究,但对多点突变对S蛋白与受体的结合亲和力的影响的研究仍然有限,因此迫切需要对此进行深入研究。本文聚焦于S蛋白突变体与人类ACE2受体结合亲和力的变化,通过在全长S蛋白及受体结合域(Receptor-binding domain,RBD)高频突变区引入多点突变,结合计算模拟方法,系统地研究了S蛋白突变体与ACE2结合亲和力的变化。本文的主要研究内容如下: (1)通过构建全长S蛋白突变文库,引入多点突变,通过高通量筛选实验评估全长S蛋白突变体与ACE2的亲和力,并对突变体的亲和力和上位性效应进行定量计算。研究发现,与全长S蛋白其他区域相比,RBD区域的大部分突变倾向于降低亲和力;包含RBD区域突变的多点突变组合更倾向于提高S蛋白突变体的亲和力。 (2)在上述全长S蛋白的研究基础上,构建RBD高频突变区的多点突变文库,对RBD区域突变对亲和力变化的影响进行了研究。研究发现,在高亲和力变异株N501Y和D614G基础上,RBD区域的大部分突变会导致S蛋白-ACE2亲和力降低,但亲和力提高的突变体中更多地包含二点或三点突变的组合。 (3)使用上述研究的实验数据,基于机器学习方法建立了S蛋白-ACE2结合亲和力定性预测模型。结果表明,基于ProtVec表征方法的随机森林模型表现最佳;在外部验证数据集上对模型进行评估,验证了该模型在定性预测结合亲和力变化方面的有效性。 本文通过高通量突变筛选实验和计算模拟相结合的方法,对S蛋白突变体与ACE2的结合亲和力进行了研究,发现了影响亲和力的S蛋白突变特征,建立了亲和力变化定性预测模型,这能够增进对病毒进化的理解,并对未来类似病毒的研究提供了方法学参考。