关键词： 新冠肺炎   阿兹夫定片   药理机制   临床疗效   安全性  

摘要： 目的：　　新型冠状病毒（SARS-CoV-2）于2019年底首次被发现，并随后造成全球范围大流行。其是一种RNA病毒，不仅能通过呼吸道造成肺组织损伤，还能传播到宿主的多个肺外器官，如肝脏、心脏、大脑等，造成全身多器官损伤。新型冠状病毒不仅传播能力强，还能在传播过程中发生基因突变和基因重组，这增加了其在体内复制能力、对疫苗的免疫逃逸能力以及人体的感染和再感染机率。因此，及时有效的抗病毒治疗是抑制病毒传播、防止感染者发展为严重疾病或死亡的最重要方案之一。　　尽管自新型冠状病毒疫情爆发以来，诸多防治药物问世，如单克隆抗体、中医药方剂、奈玛特韦俐托那韦（Paxlovid）、阿兹夫定片（Azvudine Tablets）等，然而尚无哪种药物有明确的有效性和安全性循证医学证据。甚至随着病毒的不断变异，早期可能有效的药物，在病毒变异后疗效大打折扣。虽然目前全世界对于新型冠状病毒引起的疫情放松警惕，但是该病毒并没有完全消失，而是依然在不断变异并传播。2024年1月世界卫生组织提出“X疾病”（未知的病原体或任何因变异而具备大流行潜力的已知病原体）可能导致“比新型冠状病毒大流行还要高20倍的死亡率”，不能排除新型冠状病毒不会成为“X疾病”的一个病原体。因此积累此次攻坚新型冠状病毒的预防和治疗经验，为日后可能再次出现的冠状病毒大流行防患于未然尤为重要。　　阿兹夫定片（Azvudine Tablets）是国内首个自主研发并获批用于治疗新型冠状病毒感染患者的口服小分子抗病毒药物，其不仅能抑制RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）,而且还能在胸腺中聚集，促进胸腺功能恢复，调节免疫。已有研究证明其能够缩短新型冠状病毒感染者的核酸转化阴性时间、住院时间、降低病毒载量、复合疾病进展结局和住院率，且无治疗相关不良事件或严重不良事件报告。但这些研究的样本量局限，并且是单中心研究，目前需要更大样本量的循证医学证据来进一步证明其有效性和安全性。　　本研究旨在探讨阿兹夫定片在新型冠状病毒感染住院患者中的有效性和安全性。因此，通过收集河南省九家医院的临床患者病历资料，建立了一个大样本量的多中心回顾性研究队列。通过比较使用阿兹夫定片治疗与未使用阿兹夫定片治疗的新型冠状病毒感染患者的数据，探究在真实世界中阿兹夫定片治疗新型冠状病毒感染住院患者的有效性和安全性。本研究结果为阿兹夫定片治疗新型冠状病毒感染者的临床应用提供了更有力的循证医学证据，为以后可能再次出现的冠状病毒大流行提供药物以及研究思路参考。　　方法：　　收集2022年12月5日至2023年1月31日期间河南省9家医院（郑州大学第一附属医院、河南省胸科医院、河南省传染病医院、光山县人民医院、郑州大学附属洛阳中心医院、商丘市立医院、安阳市第五人民医院、南阳市中心医院、封丘县人民医院）的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染的住院患者，共32864例。剔除年龄低于18岁患者（1314例）以及接受其他抗病毒药物治疗患者（1607例）后，共29943例患者符合纳入及排除标准被纳入本回顾性队列研究，其中使用阿兹夫定片治疗的患者5838例，未使用任何抗病毒药物的常规治疗患者24105例。经过1∶1倾向评分匹配，使用阿兹夫定片治疗的患者5801例，为阿兹夫定组;未使用任何抗病毒药物的常规治疗患者5801例，为对照组。主要结局是全因死亡，次要结局是复合疾病进展（轻、中度患者进展为重症或危重症;重症患者进展为危重症（休克、需要机械通气或ICU监护）;发生死亡）。从确诊新型冠状病毒感染的日期，追踪患者到结局事件发生或至30天为止。　　采用Kaplan-Meier分析、Log-rank检验，探究与对照组相比，使用阿兹夫定片是否能降低新型冠状病毒感染住院患者的全因死亡和复合疾病进展累积发生率;亚组分析进一步探讨在不同基线特征的特定人群中，阿兹夫定片对全因死亡和复合疾病进展的影响。此外，为检验研究结果的稳健性，分别采用缩小人群法，logistic回归法以及平均值填充缺失数据法，重新对29943例患者进行1∶1倾向评分匹配，Kaplan-Meier分析、Log-rank检验对主要结局和次要结局进行分析。　　安全性结果根据不良事件的所有等级（不良事件≥3级）进行评估。所有不良事件均按照不良事件通用术语标准5.0（CTCAE5.0）定义。收集两组患者治疗后发生不良事件的数据，使用卡方检验比较阿兹夫定组与对照组之间不良事件发生率是否有统计学差异，进而探究阿兹夫定片治疗新型冠状病毒感染住院患者的安全性。　　结果：　　1.共纳入32864例新型冠状病毒感染的住院患者，其中使用阿兹夫定片治疗的患者5838例，未使用任何抗病毒药物的常规治疗患者24105例。经过1∶1倾向评分匹配后，阿兹夫定组与对照组各有5801例患者被纳入研究分析;2.主要结果:Kaplan

关键词： 新冠肺炎   病灶区域   深度学习   图像分割   DeepLabV3+  

摘要： 新冠肺炎是一种传染性极强的呼吸道传染性疾病,感染后可能对患者肺部造成不可逆的损害,它的出现对人类的生产生活造成了极大的负面影响。临床上使用计算机断层扫描等医学成像技术对患者肺部进行扫描,放射科医生可通过肺部CT影像判断患者肺部感染情况,但实际上需要经验丰富的医生花费较多的时间和精力才能准确的分析医学图像。因此,研究出能够自动化对新冠肺炎患者肺部病灶区域进行分割的方法非常有必要,不仅可以降低经验门槛,还能提升分析效率。由于新冠肺炎肺部CT图像病灶区域分布的多样性,深度学习方法相较于传统的图像分割方法有更高的准确性和泛用性。本文基于深度学习的新冠肺炎病灶分割方法如下:首先对原始肺部CT图像进行预处理,提升对比度,减少噪声干扰;然后使用设计的MSRMNet网络模型完成肺部CT图像背景和肺部区域的预分割,提取出肺部区域,排除背景的干扰;最后使用改进的DeepLabV3+模型完成对CT图像肺部病灶区域的分割。本文的具体工作主要包括: (1)针对肺部CT图像有用区域和背景区域对比度接近的问题,使用限制对比度自适应直方图均衡算法(CLAHE)预处理图像以提高图像局部对比度并减少噪声的干扰。实验结果表明,使用该算法处理后的图像在肺部和背景区域预分割任务上,相较于原始肺部CT图像,分割精度有小幅提升。 (2)针对背景区域对肺部病灶区域分割干扰的问题,提出一种基于多尺度残差模块的网络模型MSRMNet用于背景区域和肺部区域的预分割,模型结合了多尺度结构和残差结构,可以提升模型的特征提取能力,使用Focal Loss损失函数有效缓解类别不平衡的问题。实验结果证明所提模型可准确的分割出肺部CT图像肺部和背景这两类区域,为后续肺部病灶区域分割奠定了良好基础。 (3)改进DeepLabV3+网络模型用于CT图像肺部病灶区域分割,针对肺部病灶区域大小、形状和数量分布多样的特点,提出一种基于可变形卷积的ASPP模块,这可以提升模型捕捉病灶区域复杂边界特征信息的能力。针对特征融合操作信息过载的影响,提出并引入一种平行双重注意力模块,可以自适应的强调重要特征信息,忽略不相关的特征信息。改进后DeepLabV3+模型与原DeepLabV3+模型及其它经典模型进行了比较,实验结果表明,改进后DeepLabV3+模型具备更好的分割性能。

关键词： 新型冠状病毒   变异株   Ad5-nCoV疫苗   T细胞免疫   T细胞表位  

摘要： 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情于2019年底爆发,迅速造成全球大流行,对人类健康和社会经济产生了深远的影响。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是COVID-19的病原体,其表面的刺突（Spike,S）蛋白是病毒入侵宿主细胞的关键因子,也是疫苗设计的主要靶点。SARS-CoV-2基因组的突变导致了多种变异株,如Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron。它们不仅增强了病毒的复制效率和免疫逃避能力,也对公共卫生策略和疫苗设计提出了挑战。尽管SARS-CoV-2变异株能显著逃逸体液免疫,但T细胞免疫反应对变异株和原型株的反应相似,超过80%的T细胞反应性得以保留。腺病毒载体新冠病毒疫苗单次免疫能诱导强烈的体液免疫和细胞免疫反应,在新冠疫情得到广泛应用,本项工作在动物和人体水平开展了腺病毒载体新冠疫苗的特异性细胞免疫反应及其T细胞表位特征研究,深入比较了新冠病毒变异株S蛋白变异对于T细胞反应及其细胞表位的影响,并对T细胞表位功能进行了评价,研究结果可对优化疫苗策略和应对病毒变异提供参考。 相比于人体复杂多样的HLA分型,近交系小鼠的遗传背景一致,为T细胞表位研究提供了便利。在SARS-CoV-2的多种变异株中,从Omicron起S蛋白的氨基酸突变数量超过了30个。我们选择SARS-CoV-2原型株和BA.1株的S蛋白开展研究。BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠分别免疫5型腺病毒载体新冠病毒原型株疫苗Ad5-Spike-WT和BA.1株疫苗Ad5-Spike-BA.1后,两种疫苗诱导的针对原型株和BA.1株S蛋白的细胞免疫反应存在差异,说明BA.1突变导致了S蛋白上T细胞表位的变化。使用二维肽库法对原型株和BA.1株S蛋白H-2d和H-2b单元型T细胞表位进行筛选。在BALB/c小鼠中,共鉴定出11个原型株和BA.1株的S蛋白T细胞表位,其中两个是CD4+T细胞表位,其余全是CD8+T细胞表位。11个表位中有4个涉及BA.1突变,其中CD4+T细胞表位W61-75在BA.1 S蛋白中发生A67V和Del 69-70突变,突变后不能激活CD4+T细胞;CD8+T细胞表位W505-513经过Y505H突变对表位活性没有影响;而BA.1 S蛋白上的T细胞表位O475-483和O486-494则是经T478K、E484A和Q493R、G496S突变后形成的新表位,其在原型株S蛋白上的相应肽段不能激发T细胞发应。在C57BL/6小鼠中,共鉴定出9个T细胞表位,其中CD4+T细胞表位只有一个。有两个表位涉及BA.1突变,W61-75突变后表位活性失效,而O645-653则是经H655Y突变后形成的新表位。以上经筛选鉴定获得的S蛋白11个H-2d单元型和9个H-2b单元型T细胞表位,大部分不受BA.1株突变影响,说明S蛋白的BA.1株突变对T细胞免疫的影响有限。我们采用了H-2d的优势表位W268来制备肽-MHC分子四聚体,并对免疫后的BALB/c小鼠脾脏中的抗原特异性T细胞进行了检测。结果显示,无论是接种Ad5-Spike-WT还是Ad5-Spike-BA.1疫苗的小鼠,其抗原特异性T细胞的数量均无显著差异。在C57BL/6小鼠中也观察到了相同的现象。这一发现表明,无论是原型株还是变异株疫苗,保守表位在激发细胞免疫方面的作用都是一致的。 T细胞免疫是机体免疫反应的重要组成部分,在清除病毒感染中发挥重要作用。为了评价这些筛选到的T细胞表位的体内生物学效应,选择针对BA.1株的6个MHC I类H-2b单元型表位,分别使用柔性连接子GGGGS和刚性连接子EAAAK以及AAY将表位连接形成新的抗原。使用Alpha Fold预测表位排序组合形成的各720个新抗原的结构,基于抗原蛋白的理化性质和二级结构占比,三种连接方式各选择5种经不同排序产生的抗原,加入t PA信号肽和Flag标签,并对其基因密码子进行优化。在转染的细胞中,GGGGS和EAAAK连接的抗原均能表达,其中EAAAK-1表达量最高。选择表达水平最高的EAAAK-1抗原,构建mRNA疫苗形式的T细胞表位抗原肽,单针免疫C57BL/6小鼠后14天即可激发T细胞免疫反应,加强免疫后14天的细胞免疫高于单次免疫Ad5-Spike-BA.1疫苗的反应水平,表明该mRNA抗原肽能够诱导强烈的T细胞免疫反应。同时,该T细胞免疫反应具有良好的交叉反应性,其免疫小鼠的脾细胞分别经WT、BA.1、BA.4/5和XBB S蛋白的重叠肽库刺激培养后,其细胞免疫反应无显著差异。采用相同的策略构建了H-2d单元型T细胞表位抗原肽,分别制备了仅CD4+T细胞表位的抗原肽S4,仅CD8+T细胞表位的抗原肽S8,以及同时包含CD4+和CD8+T细胞表位的抗原肽S48和A48。这四种抗原肽均可诱导B

关键词： RNA依赖性RNA聚合酶   抑制剂   核苷类似物   非核苷类似物   新型冠状病毒  

摘要： 由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型导致的新型冠状病毒感染席卷全球，寻找广谱抗病毒特效药一直是一项重大任务。RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶是一类不同病毒间在结构和功能上高度保守的关键非结构蛋白，针对该聚合酶为靶点开发新的小分子抑制剂至关重要。本文作者从新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结构为出发点，详细阐述了该病毒RNA依赖性RNA聚合酶的作用机制以及不同种类抑制剂的特点。着重从药物化学的角度介绍了核苷类似物和非核苷类似物的作用特点和作用机制，综述了多种小分子聚合酶抑制剂化学结构与生物活性之间的关系。