关键词： 疫苗佐剂   益气增免方   新型冠状病毒   组方配伍  

摘要： 目的:为防控新型冠状病毒肺炎疫情提供中医药新的防范方案,探讨益气增免方作为一种疫苗佐剂的应用。该方剂由经典的补气剂四君子汤化裁而来,以药性配伍和功效剖析为基础,分析了益气增免方与疫苗的配伍效应及其影响机制。方法:该文章应用《古代经典名方数据库》对益气增免方方剂组成开展了相似度比对研究,并从药性、配伍、功效等不同方面剖析益气增免方的配伍理论基础,分析其与疫苗的配伍效应及其影响机制。结果:中药疫苗佐剂益气增免方作为一种中医药复方,聚焦于肺脾二脏,提升肺脾之气。肺为气之主,机体通过肺脏呼吸新鲜空气,并在肺内交换体内浊气,气在肺中交替循环,保证人体正常的呼吸;脾主运化,是气机升降之枢纽,而气正是代谢功能的具象。通过调节气机、增强气血功能,益气增免方可以增强免疫原性,为增强疫苗免疫效果提供理论依据。结论:益气增免方具有益气健脾,理气燥湿,增强免疫力的功效。通过对疫苗佐剂益气增免方中医理论的深度剖析,结合前期临床及基础实验研究结果,提示益气增免方可能具有增强疫苗接种后的免疫反应诱导和维持免疫记忆,而其是如何能对复杂的免疫调控网络进行有效调理的,还需进一步阐明。

关键词： XBB   致病性   流行特征   免疫逃逸   疫苗效果   防控措施  

摘要： 随着新型冠状病毒(SARS-CoV-2)不断进化和变异,相继出现多种变异株。XBB变异株于2022年8月13日首次在印度发现,具有传播快、适应性强、免疫逃避等特点,逐渐成为全球主要流行毒株。本文就XBB变异株的致病性、流行特征、免疫逃逸特性和现今疫苗效果等进行总结并对未来应对XBB的防控方式提出建议。

关键词： COVID-19   SARS-CoV-2   Vaccination   Fractional dose   Half-dose   Booster   BNT162b2   ChAdOx1   BBIP- CorV   Gam-COVID-Vac   Sputnik V  

摘要： Background COVID-19 vaccine booster doses restore vaccine effectiveness lost from waning immunity and emerging variants. Fractional dosing may improve COVID-19 booster acceptability and uptake and will reduce the per -dose cost of COVID-19 booster programmes. We sought to quantify the immunogenicity, reactogenicity, and safety of a halfdose BNT162b2 (Pfizer-BioNTech) booster relative to the standard formulation. Methods This randomised, controlled, non -inferiority trial recruited adults in Mongolia primed with a two -dose homologous ChAdOx1 nCov-19 (Oxford-AstraZeneca, n = 129 participants), BBIBP-CorV (Sinopharm (Beijing), n = 399), or Gam-COVID-Vac (Gamaleya, n = 70) schedule. Participants were randomised (1:1) to receive a 15 mu g (half -dose) or 30 mu g (full -dose) BNT162b2 booster. Participants and study staff assessing reactogenicity were blinded up to day 28. Co -primary endpoints were Wuhan -Hu -1 anti -spike S1 IgG seroresponse 28 days postboosting and reactogenicity within 7 days of boosting. The non -inferiority margin for the absolute difference in seroresponse was -10%. Differences in seroresponse were estimated from logistic regression with marginal standardisation. Geometric mean ratios of IgG were also estimated. *** Identifier: NCT05265065. Findings Between May 27th and September 30th, 2022, 601 participants were randomized to full -dose BNT162b2 (n = 300) or half -dose (n = 301). 598 were included in safety analyses, and 587 in immunological analyses. The frequency of grade 3-4 reactions was similar between arms (half -dose: 4/299 [1.3%];full -dose: 6/299 [2.0%]). Across all severity grades, half -dose recipients reported fewer local and systemic reactions (60% versus 72% and 25% versus 32%, respectively). Seroresponse was 84.7% (250/295) and 86.6% (253/292) in the half -dose and fulldose arms, respectively (Difference: -2.8%;95% CI -7.7, 2.1). Geometric mean IgG titres were similar in those receiving full and half -dose boosters f

关键词： ChAdOx1 (AstraZeneca)   COVID-19 infection   IgG antibodies   previous infection   SARS-CoV-2  

摘要： BackgroundCurrent vaccines against COVID-19 effectively reduce morbidity and mortality and are vitally important for controlling the pandemic. Between December 2020 and February 2021, adenoviral vector vaccines such as ChAdOx1 (AstraZeneca-Oxford) were put in use. Recent reports demonstrate robust serological responses to a single dose of messenger RNA vaccines in individuals previously infected with SARS-CoV-2. We aimed to study the association between previous COVID-19 infection and antibody levels after a single dose of ChAdOx1 *** cross-sectional study was conducted on 657 individuals who were either convalescent or SARS-CoV-2 naive and had received one dose of ChAdOx1 (AstraZeneca). A questionnaire was used to collect data on age, sex, and self-reported history of COVID-19 infection. We then compared the average levels of immunoglobulin G (IgG) between the previously infected and COVID-19-naive *** compared the antibody responses of individuals with confirmed prior COVID-19 infection with those of individuals without prior evidence of infection. The mean antibody levels in those who reported no history of COVID-19 infection were substantially lower than in those who were previously infected, in both males and females. Sex-related differences were observed when we compared antibody levels between men and women. In males, anti-S IgG antibody levels were higher in those who had been previously infected (156.1 vs. 87.69 AU/mL, p = .009), compared with the same pattern was observed in females (113.5 vs. 90.69 AU/mL, p = .005).ConclusionsPrevious COVID-19 infection is associated with higher levels of SARS-CoV-2 antibodies following ChAdOx1 (AstraZeneca) vaccination. Our finding supports the notion that a single dose of ChAdOx1 nCoV-19 administered post-SARS-CoV-2 infection serves as an effective immune booster. This provides a possible rationale for a single-dose vaccine regimen for previously infected individuals. Previous COVID-19

关键词： 新冠肺炎   肺部疾病   医学影像处理   卷积神经网络  

摘要： 医学影像尤其是胸片(X光)的快速分割与分类,对肺部疾病的定性诊断最为常用。必须有经验的放射科医生解读。但有时训练有素的专家也会曲解X光影像,因此新的AI算法近年来不断被引入对医学影像进行分割和分类。新冠肺炎(COVID-19)的全球爆发引发了全球卫生系统的严重挑战,特别是公共卫生和医疗体系并对肺部疾病的更为深刻关注,而医学影像处理技术在这一背景下显得尤为关键。胸部X光片是一种非侵入式、迅速的医学影像检查手段,在COVID-19的诊断和治疗中扮演着重要角色。 本论文从全面的角度出发,以应对肺部疾病的迫切需求为出发点,深入研究了两种先进的胸片医学影像处理方法:一是基于卷积神经网络(CNN)的肺部区域特征提取和分类研究,二是基于Transformer模型的四种肺部疾病分类研究。 首先,论文提出了一种用于胸部X光片的新型COVID-19肺部精确分割深度网络(Focus-Net)。使用BN+Leaky Re LU模块来捕获更多的高级特征并保留更多的空间信息,并将提出的BN+Leaky Re LU模块与UNet结构相结合,用于医学图像分割。并应用于新冠肺炎、正常肺部、肺炎的胸部X光片肺部图像分割。后将进行分割后的肺部图像使用Res Net18进行分类,模型的关注点聚焦到肺部区域,提高了分类可信度。 其次,论文采用了Swin Transformer模型,通过对四种常见肺部疾病(包括新冠肺炎、普通肺炎等)的深入分类研究并与代表性的CNN网络(Res Net-50、Res Net-18和VGG16)进行了对比分析,模型更加聚焦于肺部区域,使得分类更加精准。通过将深度学习技术应用于胸部X光片的肺部精确分割和分类,成功提高了COVID-19的诊断效率和分类的可信度和准确性。通过对比这两项研究,验证了它们在肺部疾病分割分类任务中的有效性和准确性,也为当前肺部疾病的快速诊断提供了技术支持。

关键词： SARS-CoV-2   致病性差异   宿主限制性因子   ACE2   MHC   TLR9  

摘要： 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发了全球范围新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行,对社会发展和公众健康造成了前所未有的挑战。COVID-19患者症状表现不一,包括无症状感染和轻微的类流感症状、肺炎和严重的急性呼吸窘迫综合征,病情严重者甚至死亡。SARS-CoV-2对宿主的致病性主要受病原和宿主两方面的影响。病原影响因素主要取决于病毒的变异。宿主因素,特别是基于遗传背景差异的宿主限制性因素及其作用机制仍不清晰。本研究在生物安全三级实验室中借助动物感染实验,深入探索了血管紧张素转换酶2（ACE2）、主要组织相容性复合体（MHC）和Toll样受体9（TLR9）等宿主限制性因子在SARS-CoV-2对不同宿主致病差异中的作用机制。 首先,我们证明受体ACE2的353位点决定不同刺猬对SARS-CoV-2的易感性。本课题组前期研究发现SARS-CoV-2在非洲迷你刺猬（Atelerix albiventris,AA）和东北刺猬（Erinaceus amurensis,EA）中的致病性存在差异,SARS-CoV-2对EA的致病性显著弱于AA。考虑到ACE2受体的特异性和多态性是决定病毒宿主范围、组织倾向性和致病情况的主要因素,因此本研究首先对两种刺猬的ACE2基因进行了测序分析。结果显示,两种刺猬的ACE2存在8个氨基酸差异,其中353位点位于ACE2与SARS-CoV-2受体结合结构域（RBD）相互作用的界面上,这提示我们两种刺猬的ACE2受体介导病毒入侵细胞的能力可能存在差异。随后细胞水平的感染实验显示,过表达人源ACE2（h ACE2）和AA ACE2的HEK 293T细胞可以被SARS-CoV-2感染,过表达EA ACE2的细胞几乎不被感染。而当过表达h ACE2K353N和AA ACE2K353N突变蛋白时,病毒感染细胞的能力显著下降。我们还检测了表达于细胞表面或体外纯化的ACE2蛋白与SARS-CoV-2 RBD蛋白的结合能力,免疫荧光、流式细胞术和表面等离子共振等多种实验均显示不同ACE2与SARS-CoV-2 RBD的结合能力存在差异,h ACE2和AA ACE2与RBD强结合,而EA ACE2几乎不与RBD结合。特别是当h ACE2的353位点由赖氨酸（K）突变为天冬酰胺（N）时,其与SARS-CoV-2 RBD的结合力下降了70余倍。分子模拟对接结果显示,当ACE2的353位点为K时,此位点与SARS-CoV-2 RBD的甘氨酸（G）496位点形成了关键的作用力。因此,宿主ACE2受体的多态性是SARS-CoV-2导致不同刺猬差异致病的原因,其中ACE2353位点发挥关键作用。 其次,我们发现主要组织相容性复合体MHC的差异导致了小鼠适应株SARS-CoV-2/BMA8对不同品系小鼠的差异性致病。SARS-CoV-2/BMA8能够同时感染遗传背景不同的BALB/c和C57BL/6N小鼠,但它在两种小鼠中引起的致病表型存在显著差异,体现为BALB/c小鼠中更高的病毒载量、炎症水平以及更严重的病理损伤。此外,SARS-CoV-2/BMA8的感染导致BALB/c小鼠死亡,而对C57BL/6N小鼠不具有致死性。SARS-CoV-2依赖S蛋白与ACE2受体的结合得以入侵细胞,因此ACE2受体是决定宿主能否被感染以及感染程度的首要因素。然而我们的结果显示,BALB/c和C57BL/6N小鼠体内的Ace2基因序列完全一致,且蛋白表达量也没有差异。考虑到MHC与ACE2均在病毒入侵宿主的起始阶段发挥作用且MHC本身也是宿主抵抗病毒感染的重要因素,因此由MHC引起的宿主对病毒易感性的差异值得深入研究。而MHC中与病毒感染关系最直接的是MHC I类分子,我们比较了两种小鼠的MHC I类分子,发现确实存在差异。当使用H-2Kb单克隆抗体阻断C57BL/6N小鼠体内的MHC I类分子后,SARS-CoV-2/BMA8的感染性和致病性显著增强。流式细胞术结果显示,SARS-CoV-2/BMA8的感染会造成小鼠外周血中CD8+T细胞数量下降,而阻断MHC I则进一步降低了C57BL/6N小鼠体内CD8+T细胞的数量。 最后,我们证明模式识别受体TLR9在SARS-CoV-2/BMA8对不同品系小鼠的差异致病中发挥重要作用。年龄和高血压、糖尿病等多种基础疾病是影响新型冠状病毒感染后重症发生的重要因素,提示病毒对宿主的致病强度与先天免疫高度相关。适度的天然免疫与炎症反应会产生抗病毒效果,并进一步激发适应性免疫保护机体;过度的天然免疫与炎症反应却会导致免疫过激、炎症因子风暴等,进而伤害机体。为揭示病毒感染前后不同宿主体内的免疫响应差异,本研究对BALB/c和C57BL/6N小鼠感染SARS-CoV-2/BMA8前后的肺组织进行了转录组

关键词： COVID-19   气道基底干细胞   分化   炎症   纤维化   COVID-19   气道基底干细胞   间充质干细胞   炎症   干扰素  

摘要： 第一部分:新型冠状病毒肺炎患者气道基底干细胞的功能特征及其分子机制 [研究背景]: COVID-19是SARS-CoV-2引发的急性传染病。SARS-CoV-2主要破坏气道和肺部上皮,导致宿主免疫反应失衡,引发一系列严重的临床症状。气道基底干细胞(BSC)作为气道的成体干细胞,可对损伤后气道进行修复。而COVID-19患者在急性期的气道广泛渗出和慢性期的纤维化都提示气道复旧过程障碍,而目前没有相关研究描述COVID-19感染后BSC的增殖、分化特征及参与气道炎症和纤维化的相关机制。 [研究目的]: 本研究旨在通过构建高效的COVID-19 BSC分离方案,鉴定后利用体外和体内分化模型,评估COVID-19患者BSC的扩增能力、分化倾向、炎症和促纤维化特性,并通过转录组分析初步探索参与该过程其分子机制。 [研究方法]: (1)BSC分离及鉴定:研究共纳入非COVID-19健康/疾病对照和COVID-19患者各11例。通过支气管镜刷检技术从气道样本中提取原代BSC,并使用免疫荧光染色法来验证BSC的特异性表面标志物。 (2)BSC扩增及分化能力的研究:以克隆形成评估这些BSC的扩增能力,分别以气-液界面培养(ALI)(体外实验)和重度免疫缺陷(NCG)小鼠皮下移植(体内实验),评估BSC在体外及体内环境下形成的类气道组织特点。 (3)炎症与纤维化特性分析:通过对NCG小鼠皮下异种移植物组织进行组织病理和免疫病理染色,评估急性炎症细胞浸润和组织纤维化的程度。同时,通过将BSC与人胚肺成纤维细胞-1(HFL-1)共培养,探索BSC在体外对纤维化的影响。 (4)转录组学分析:通过转录组测序及后续的生物信息学分析,比较COVID-19组BSC、ALI与对照组的差异,以揭示COVID-19组BSC分子层面的改变。 [结果] (1)成功分离11例非COVID-19健康/疾病对照和11例COVID-19患者的BSC,两组BSC均呈现双阳性表达KRT5和P63(BSC标记物)。 (2)两组BSC在P5代时克隆形成率无显著差异。ALI、异种移植物实验结果显示,对照组BSC能够诱导形成纤毛柱状样气道上皮结构;而COVID-19组BSC所诱导的上皮结构中则出现了杯状细胞明显增殖(p<0.0001)。 (3)COVID-19组异种移植物中,中性粒细胞浸润水平、成纤维细胞活化水平较对照组异种移植物显著增加(p<0.0001,p<0.01)。COVID-19组BSC与HFL-1共培养后,HFL-1的间质标记物α-SMA表达上升。 (4)描绘COVID-19组BSC、ALI转录组景观结果显示:对照组BSC、COVID-19组BSC分化后,主成分差异明显;在COVID-19组ALI中,与抗氧化物质产生相关的基因显著下调,而与黏液分化、炎症和纤维化相关的基因和通路显著上调。 [结论]: 对照组和COVID-19组BSC均获得成功分离,COVID-19组BSC在增殖能力上与对照组无显著差异,但其分化形成的类气道结构中黏液细胞比例明显升高,可能是导致气道上皮出现与COVID-19临床症状相关的黏液高分泌改变的原因。COVID-19组BSC呈现出明显的炎症和纤维化反应,其中与炎症及纤维化紧密相关的基因和通路表达水平显著上升。这些变化与COVID-19的病理特征相吻合,揭示了 SARS-CoV-2感染可能诱发肺部炎症和纤维化进程的潜在机制。 第二部分:间充质干细胞对新型冠状病毒肺炎患者气道基底干细胞炎症、杯状细胞化生和纤维化的治疗作用研究 [研究背景]: COVID-19感染导致的免疫紊乱和炎症风暴是致死的重要原因。间充质干细胞(MSC)是一种具有广泛免疫调节功能干细胞,全身给药可以使ARDS病人获益。但是目前尚不明确MSC对COVID-19患者BSC的作用。 [研究目的]: 在体外和体内模型中利用MSC、COVID-19组BSC共培养模型,探索MSC在改善COVID-19组BSC炎症、黏液分泌和纤维化方面的作用和机制。 [研究方法]: (1)COVID-19组BSC与MSC体内共培养模型:分为三组,第一组为COVID-19 BSC单独接种组[COVID-19]。第二组为MSC尾静脉给药组[MSC(i.v.)]。第三组为MSC皮下给药组[MSC(s.c.)]。在第21天,统一收集各组的异种移植物并进行后续检测。 (2)各组异种移植物炎症浸润、分化、纤维化特征的检测与分析:分别通过HE、免疫荧光染色、免疫组化染色对各组异种移植物中炎症程度、分化特点、纤维化程度进行表征。 (3)COVID-19组BSC与MSC体外共培养模型及转录组检测分析:分为COVID-19组与MSC共培养组,共培养组将分化至第8天的COVID-19 AL

关键词： 新冠病毒变异株   抗体反应   广谱中和抗体   双特异性抗体  

摘要： 截至2024年3月3日,由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒感染（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）已导致全球超过7.7亿人感染,七百多万人死亡,对人类生命健康及全球公共卫生安全构成了前所未有的威胁。在其流行期间,多款新冠疫苗及中和抗体药物获得批准或紧急使用授权,为疫情防控作出了巨大贡献。然而,随着病毒的持续进化,新的变异株不断涌现,其中Delta株、Omicron株及其多种亚变种已展现出显著的免疫逃逸特性,导致现有疫苗和抗体药物的保护效果大幅度降低甚至失效。为此,本研究致力于研发能强效中和Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron及其亚变种的广谱性单抗。同时,针对病毒的快速进化问题,进一步提出并验证了双特异性超广谱中和抗体的解决方案,以期为新冠病毒变异株的防治提供新的临床候选药物。 对重组新型冠状病毒疫苗（adenovirus type 5-vectored COVID-19 vaccine,Ad5-nCoV）免疫后人体的抗体反应进行初步分析,结合新一代高通量测序技术（Next-generation sequencing,NGS）探究疫苗免疫前后机体B细胞受体（B cell receptor,BCR）库的变化,发现加强免疫Ad5-nCoV疫苗能够刺激机体产生长期有效的广谱中和抗体反应,揭示从Ad5-nCoV疫苗免疫志愿者体内筛选新冠变异株的广谱中和抗体,是一种可行的抗体研发策略。 在Alpha、Beta、Gamma、Delta这些关切变异株（variant of concern,VOC）流行之际,基于流式分选-单细胞PCR技术平台,从加强免疫Ad5-nCoV疫苗的记忆B细胞中筛选出19株对这些VOC具有交叉结合活性的单抗,其中84%的抗体能够交叉结合具有强免疫逃逸能力的Omicron株,32%的抗体具有广谱中和活性。分析功能抗体的序列及进化轨迹发现,强效中和抗体ZWD12的克隆型在加强免疫后半个月和一个月出现,ZWD12使用的IGHV3-7和IGHJ4基因组合位于B细胞受体（B cell receptor,BCR）最常用的前10种组合之内。单抗ZWD12对VOC具有强效中和活性,可以完全保护受强致病性Delta株攻击的小鼠。冷冻电镜解析抗原抗体复合物结构发现ZWD12靶向病毒刺突蛋白（spike protein,S）的受体结合基序（receptor-binding motif,RBM）,通过阻断病毒与血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）的结合发挥中和作用。 Omicron出现后迅速取代其他VOC,且在传播过程中出现多种亚变种,如BA.1-BA.5。因此,我们采取相同技术方法筛选得到一株对WT、以前流行的VOC以及BA.1-BA.5均具有良好中和活性的单抗ZW2G10。体内实验显示,ZW2G10可以通过腹腔注射或鼻内给药的方式,为仓鼠提供针对BA.1的保护。结构解析发现ZW2G10能够同时与RBD及S蛋白三聚体中相邻单体的NTD相互作用。与ZWD12不同,ZW2G10通过抑制病毒与受体结合及抑制膜融合两种机制发挥抗病毒功效。然而,随着Omicron的不断变异,BA.2和BA.4/5衍生出了BF.7、XBB.1.5等含R346T突变的子代亚分支,对于这些具有强烈免疫逃逸能力的子代亚变种,我们进一步筛选得到了两株与ZW2G10不竞争的中和单抗H4B6和H4D12。 考虑到单抗在应对病毒免疫逃逸方面具有局限性,我们采取构建双特异性抗体（bispecific antibody,bsAb）的策略以提升抗体的广谱性和有效性。比较DVD、Cross Mab及Ig G-（sc Fv）2三种构型的双特异性抗体发现,以受病毒突变影响较小的亲本单抗作为Ig G骨架构建的Ig G-（sc Fv）2型双特异性抗体表现出最强的中和效力。基于此,我们进一步构建了两株强效双特异性抗体,分别为以H4B6和H4D12（二者具有重叠表位）为亲本单抗构建的bsAb1,以及以H4D12和ZW2G10（二者具有非重叠表位）为亲本单抗构建的bsAb2。两株双特异性抗体在抗原结合和病毒中和方面都明显优于亲本单抗或“鸡尾酒”组合,能够强效抵御Delta株以及包括目前主流毒株JN.1在内的所有Omicron亚变种的感染。此外,我们发现由表位重叠的亲本单抗设计构建的双特异性抗体bsAb1,能够以一种独特的机制发挥抗病毒活性,即将S蛋白三聚体锁定在单一状态,使其无法发生构象变化,进而有效阻止病毒与ACE2的结合。 综上所述,本研究紧密贴合疫情防控的

关键词： 新型冠状病毒   结构蛋白   重组表位蛋白   表位疫苗  

摘要： 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）自2019年年底爆发,在全世界范围内造成了严重影响。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）不仅可致人死亡,也给社会带来持续的恐慌,造成了严重的经济损失。大范围疫情虽然已经消退,但病毒仍在持续变异,新型冠状病毒感染作为乙类传染病依然需要防控。截至2024年5月20日,全球已报告确诊病例超过7.74亿例,死亡病例超过700万例。疫苗在预防新冠病毒感染中发挥了重要作用,目前主要使用的疫苗包括灭活疫苗、亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗和核酸疫苗等。其中,新型冠状病毒亚单位疫苗因为接种后副反应小,安全性高而被广泛应用,但其需要花费大量时间和精力筛选表达完整的抗原蛋白,且免疫效果易受免疫时间和免疫佐剂影响。而表位疫苗由于直接聚焦表位,不仅节省了筛选和表达疫苗靶标的时间和精力,更减少了过敏反应的发生,且与单独的表位疫苗相比,选择多个血清学变异表位可以诱导针对病毒不同血清型更广泛的免疫应答。本研究直接使用新冠病毒候选蛋白氨基酸序列预测潜在的B细胞和T细胞表位,经一系列生物信息学工具分析预测结果,设计试验鉴定候选优势表位,通过Linkers连接不同表位和佐剂,使用原核表达系统成功获得候选表位疫苗蛋白,利用小鼠模型评价其免疫应答特性,以期为COVID-19疫苗的制备提供参考。 1.新型冠状病毒结构蛋白及辅助蛋白表位预测及鉴定 基于反向疫苗学原理,使用生物信息学方法,主要预测了SARS-CoV-2刺突蛋白（S）、核衣壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）四种结构蛋白以及辅助蛋白ORF6和辅助蛋白ORF8的B细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞表位。使用原核表达系统成功表达His和GST标签的E和M蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blotting试验鉴定。预测E线性表位分别是Ser6-Val14、Tyr57-Pro71,M蛋白线性表位分别为Thr7-Glu18、Lys180-Ala188、Tyr204-Asp215。制备E/M蛋白重组表位蛋白,使用GST标签单克隆抗体、小鼠多抗血清以及新冠病毒灭活疫苗免疫的人阳性血清通过Western blotting和ELISA试验鉴定预测的B细胞表位。ELISA结果显示重组表位蛋白包被组OD450值与非表位蛋白包被组和阴性孔差异明显,与Western blotting试验结果一致。预测E和M蛋白优势CD4+T细胞表位分别为Val17-Val25、Leu31-Leu39和Arg44-Arg52、Ala98-Ser108、Ser177-Gln185。合成相应肽段后对其进行鉴定,ELISpot和夹心ELISA结果显示,候选CD4+T细胞表位均可促进IFN-γ和IL-4的分泌;淋巴细胞增殖试验结果显示,预测T细胞表位可以诱导脾脏淋巴细胞增殖。预测E和M蛋白优势CD8+T细胞表位分别为Phe26-Leu34和Arg150-Arg158。CTL杀伤试验结果显示,预测E/M蛋白CTL表位可以特异性杀伤靶细胞,杀伤靶细胞比率分别为53%和62%,而非表位组和PBS对照组均低于20%,表明预测的CD8+T细胞表位能诱导较明显的CTL杀伤活性。 2.新型冠状病毒多表位疫苗的设计及免疫特性评价 以结构蛋白中的M、E和S蛋白以及辅助蛋白ORF6和辅助蛋白ORF8作为表位疫苗靶标蛋白,选择经前期筛选和鉴定正确的B细胞表位、CD8+T细胞表位和CD4+T细胞表位用于多表位疫苗的构建。通过KK、AAY、GPGPG、EAAAK Linkers将上述不同表位的序列进行连接,同时分别选择50S核糖体蛋白L7/L12和沙门菌鞭毛蛋白Fli C?D2?D3作为疫苗的佐剂。构建MES-50S、MES-flic、ME-50S、MES和ME等包含不同序列组成的多表位疫苗重组表达质粒,经诱导表达和纯化成功获得5种多表位疫苗重组表位蛋白r His-MES-50S、r His-MES-flic、r His-ME-50S、r His-MES和r His-ME。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,候选表位疫苗蛋白均可在上清中表达,且与His标签单抗、E/M蛋白免疫小鼠多抗血清和人临床血清均反应良好。分别将以上重组表位疫苗蛋白以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,在第14天和28天进行加强免疫,免疫剂量为80μg/只,设立PBS对照组。分别在二免12天、三免12天采血,通过间接ELISA检测小鼠血清中的抗体水平。结果显示,三免12天后,各组免疫小鼠血清Ig G抗体效价达到峰值,之后逐渐下降。检测三免12天血清中和抗体滴度发现,只在表位疫苗MES-flic、MES-50S和MES免疫小鼠血清中检测到中和抗体,其中表位疫苗MES-flic免疫小鼠血清中和抗体滴度明显高于其它两组。为进一步评价表位疫