关键词： β地中海贫血   血红蛋白病   高效液相色谱   高分辨质谱  

摘要： 目的:β地中海贫血和血红蛋白病的传统筛查方法依赖于血红蛋白结构的完整性,易受红细胞溶血和血红蛋白降解等因素影响,并且,传统筛查方法存在灵敏度与特异性不够、重复性差、前处理繁琐等不足,不适于用作筛查手段广泛使用。本研究建立基于高效液相色谱-高分辨质谱（high performance liquid chromatography high resolution mass spectrometry,HPLC-HRMS）技术筛查β地中海贫血和血红蛋白病的新方法,探讨干血滤纸片样本筛查该病的可行性,以期建立一种前处理简便、低成本、高通量的疾病筛查新方法,进一步拓宽我国产前筛查新病种,达到减少地中海贫血出生缺陷和提高人口整体素质的最终目的。方法:以HPLC-HRMS技术为基础,研究DBS样本中微量血红蛋白提取、酶解后定量的新方法。DBS样本中血红蛋白经胰蛋白酶消化后产生珠蛋白链（主要是α珠蛋白链、β珠蛋白链、γ珠蛋白链和δ珠蛋白链）的特征性肽段。DBS样本前处理液经C18色谱柱分离、纯化和浓缩,导入质谱系统。利用HPLC-HRMS技术对特征性肽段筛选,利用二级质谱鉴定特征性肽段,利用同位素内标肽段定量分析特征性肽段。优化HRMS离子源参数和Trace Finder定量软件参数,优化Ultimate 3000色谱系统的梯度参数、优化DBS前处理方法。依据建立的HPLC-HRMS法批量检测样本,通过β珠蛋白链、δ珠蛋白链特征性肽段离子碎片肽段的质谱峰面积,按公式公式（1）、公式（2）计算出δ/β比率、βM/β比率来推算Hb A2/Hb A和异常珠蛋白链,以确定不同地中海贫血突变类型的比率分布。ROC曲线分析,确定β地中海贫血和血红蛋白病的诊断分界值。通过精密度、定量低限、基质效应、携带污染、样本稳定性、干扰实验、标准曲线实验、回收率实验,对HPLC-HRMS检测方法进行方法学评价。与二代测序（Next generation sequencing,NGS）比对,以评价HPLC-HRMS法的检验效能。结果:本研究收集了674例β地中海贫血样本、25例血红蛋白病样本和629例正常对照样本用于方法学建立,通过优化前处理方法,建立了DBS样本微量血红蛋白提取方法,并筛选和鉴定出β地中海贫血和血红蛋白病的特征性肽段;利用HRMS技术对特征性肽段进行定量分析,初步建立了基于HPLC-HRMS技术筛查地中海贫血和血红蛋白病的新方法,并完成对新方法的方法学评价。通过方法学评估分析,HPLC-HRMS法的批间、批内相对标准偏差值小于10.8%;特异性肽段的定量检测限低至1.0～5.0μg/L;没有明显的基质效应或携带污染率;回收率为93.8%至128.7%;DBS样本可稳定保存至24天。ROC曲线分析,确定不同亚型β地中海贫血和血红蛋白病的诊断分界值为:β+地中海贫血,δ/β≥0.075,其灵敏度和特异性分别为99.27%和99.36%;β0地中海贫血,δ/β≥0.109,其灵敏度和特异性均为100%;血红蛋白病,βM/β≥0.000,其灵敏度和特异性均为100%。经与二代测序（NGS）方法学比对结果表明,HPLC-HRMS法诊断β地中海贫血和血红蛋白病的灵敏度为100%,特异性为99.6%。结论:我们开发了一种快速、高通量和可靠的用于儿童和成人β地中海贫血和血红蛋白病筛查的方法,未来有望用于一线筛查。

关键词： 重型地中海贫血   造血干细胞移植   同胞全相合   预处理方案  

摘要： 目的:研究本中心同胞全相合造血干细胞移植(HSCT)治疗重型地中海贫血的安全性及临床疗效，分析使用ATG-F或ATG-T预防GVHD、预处理方案中含TT和无TT的差异性。　　方法:回顾性分析2012年1月至2021年12月在深圳市儿童医院行同胞全相合HSCT治疗重型地中海贫血患者的临床数据。研究供患者移植情况、移植并发症、总体生存率(OS)、无事件生存率(EFS)、移植失败危险因素、aGVHD危险因素、cGVHD危险因素、病毒血症危险因素、ATG-F组和ATG-T组预后、含TT组和无TT组预后。　　结果:137例患者纳入研究，其中位移植年龄是6.3岁(范围2.7到14.5岁)。中位输注MNC细胞数为10.0×108/kg,中位输注CD34+细胞数为6.6×106/kg。中性粒细胞植入中位时间为16天(范围是10到30天)，血小板植入中位时间为13天(范围是7到67天)，血红蛋白植入中位时间10天(范围是5到28天)。中位随访时间44.8月(范围是2.6到129.7月)，1例(0.7％)患者死亡，预计5年OS及EFS分别为99.3％和98.5％。8例(5.8％)患者发生aGVHD,其中2例(1.4％)患者进展为Ⅲ-Ⅳ度aGVHD。11例(8.0％)患者出现cGVHD,且均无广泛性。2例(1.4％)患者诊断为原发性PGF,1例(0.7％)患者诊断为继发性PGF,1例(0.7％)患者植入失败。11例(8.0％)患者出现败血症，30例(21.9％)患者出现CMV血症，26例(19.0％)患者出现EBV血症，10例(7.3％)患者诊断IFD。5例(3.6％)患者诊断为AIHA。供患者关系为女供男为aGVHD发生的危险因素(P=0.044)。ATG-F 组和 ATG-T 组的 aGVHD 和 cGVHD 发生率分别为 5.7％vs 5.9％(P=0.97)和 8.6％ vs 8.3％(P=0.97)。含 TT 组和无 TT 组的 Ⅲ-Ⅳ 度aGVHD 和 cGVHD 发生率分别为 0％ vs 5.1％(P=0.02)和 11.9％ vs 0％(P=0.03)。　　结论:本中心同胞全相合HSTC治疗重型地中海贫血生存率高且并发症少。基于本中心移植体系，ATG-F组和ATG-T组的GVHD发生率无明显差异。含TT组的cGVHD发生率高，而Ⅲ-Ⅳ度aGVHD发生率低。

关键词： 地中海贫血   基因诊断   三代测序   光学图谱技术  

摘要： 研究背景:地中海贫血(下文简称:地贫)是世界上最常见的遗传性疾病之一,是由珠蛋白基因上的点突变和缺失导致。精准的地贫基因分型是开展遗传咨询和产前诊断的基础。目前,我国所设计的常规地中海贫血基因检测方法及试剂仅纳入了常见的20多种突变类型。传统的筛选方法都有局限性,只能检测范围有限的基因突变,遇到罕见的地贫突变可能产生错误的结果,在临床诊断中会导致误诊。第三代测序基于长读单分子测序,具有长测序长度和高检测精度特点,能够同时检测在珠蛋白基因上的点突变和复杂拷贝数变异。在本研究中,我们收集了 628例患者生物学样本,使用第三代测序的单分子实时(Single Molecule Real-Time,SMRT)测序,发现了 15种罕见突变,以及用Bionano光学图谱技术鉴定了一种含有24个额外HBA2基因的串联重复突变。研究方法:在这项研究中,对收集的628例地中海贫血病患者样本进行了血红蛋白检测和血常规分析,同时进行的地中海贫血筛查及分子诊断。最终我们将628例患者DNA样本全部被送往一个独立实验室进行SMRT测序。其中遇到一例具有高拷贝数的串联重复突变使用光学图谱进行检测。随后对获得的罕见突变样本的表型进行分析和阐述。实验结果:在628例病患中,使用SMRT及光学图谱检测出576例(91.72%)患者有α-地贫突变,17例(2.71%)患者有β-地贫突变,35例(5.57%)患者有α合并β地贫突变。其中,SMRT检测出31种变异类型,光学图谱技术鉴定1种串联重复突变。共检测出1289个阳性等位基因。总共发现了另外15种罕见的和1种新发具有临床意义的变异。对含有HBA2重复突变的家系进行qPCR和反相液相色检测,发现重复突变中的HBA2基因并不发挥作用,并且还导致α珠蛋白基因mRNA表达水平下降以及α/β珠蛋白肽链比例下降。总结与讨论:结果表明,SMRT在检测α-珠蛋白基因三倍体、罕见缺失和确定顺式或反式构型方面等具有很大优势。SMRT是一种全面、一步到位的地中海贫血筛查和诊断方法,尤其是用于检测罕见的地中海贫血突变,为更好地预防和控制地中海贫血提供了参考。对含有24个额外HBA2基因的串联重复突变进行家系分析和体外分子实验,进一步阐明该突变与表型之间的关系。该病例报告强调了珠蛋白基因座结构组织在基因活性中的重要作用,这将为研究红系发育过程中的远端增强子和珠蛋白基因启动子通讯提供新的线索。

关键词： β-地中海贫血   β-珠蛋白   Sanger测序   基因型   表型分析  

摘要： 背景与目的：β-地中海贫血（β-地贫）是β-珠蛋白基因突变导致的β-珠蛋白链合成不足或者缺如所引起的溶血性贫血病。目前已经发现的β-地贫突变类型大约有300多种，而且每年都会有不少β-地贫新发突变被发现。随着β-珠蛋白基因突变的日益增多，常见的β-地贫基因的检测技术已经无法满足β-地贫检测的需求，目前存在部分β-地贫无法被常规β-地贫基因检测所识别，我们将此类β-地贫称为罕见β-地贫。由于罕见β-地贫基因携带者不能通过常规β-地贫基因技术检测，部分临床症状较轻的携带者在产前诊断与遗传咨询中常会出现误诊或者漏诊。这些基因携带人群婚配可能会孕育β-地贫基因的纯合子或者双重杂合子，导致中间型或者重型β-地贫患儿的出生，对社会与患儿家庭都是一个沉重的负担。　　β-地贫的突变类型具有明显的民族和地域特异性。贵州是β-地贫高发区，对罕见β-地贫的诊断与分析对贵州地区的β-地贫遗传诊断与产前咨询都是非常必要的。本研究对就诊于贵州省人民医院血液学表型疑似β-地贫且常规β-地贫基因突变检测结果为阴性的受检者进行β-珠蛋白基因分析，鉴定并分析罕见的β-地贫突变的基因型，以丰富贵州地区β-地贫基因突变谱，为β-地贫的诊断与遗传咨询提供依据。　　方法：收集2020年1月至2022年3月在贵州省人民医院产前诊断中心就诊的地贫筛查人群的全血样本，进行血液学参数分析及血红蛋白电泳筛选出血常规符合小细胞低色素性贫血特征（MCVlt;80fl、MCHlt;27pg）且血红蛋白电泳结果示HbA2gt;3.5%的样本。对这批血液学表型疑似β-地贫的样本采用Gap-PCR及反向斑点杂交法，筛选出常规β-地贫基因检测结果为阴性的受检者样本21例，应用PCR技术扩增β-珠蛋白基因全长，用Sanger测序技术对扩增产物进行双向测序。测序结果与β-珠蛋白基因参考序列进行比对分析，查找是否存在罕见突变类型。　　结果：在21例疑似β-地贫患者中发现17例罕见β-地贫基因携带者，共7种突变类型：CD53(-T)、CD5(-CT)、CD8(-AA)、-88(Cgt;A)、Cap+22(Ggt;A)、IVSII-705（Tgt;G）、HBB:c.*129Tgt;A，均表现为轻型β-地贫的临床表型，其中CD53(-T)为贵州地区苗族特有突变;Cap+22(Ggt;A)、-88(Cgt;A)首次发现于中国人群;CD8(-AA)、CD5(-CT)、IVSII-705(Tgt;G)、HBB:c.*129Tgt;A首次发现于贵州人群。　　结论：1、本研究发现17例罕见β-地贫基因携带者，共计7种罕见β-地贫基因型，其中贵州苗族人群特有的β-地贫基因突变1种，中国人群中首次发现的β-地贫基因突变2种，贵州人群中首次发现的β-地贫基因突变4种。2、本研究拓展了贵州人群β-地贫基因突变谱，为本地β-地贫的遗传咨询提供了更多的支持依据。

关键词： 重型β-地中海贫血   患儿   心理行为问题   质性研究   量性研究   影响因素  

摘要： 目的:本研究采用半结构式深入访谈与横断面研究相结合,探讨桂西地区重型β-地中海贫血(Beta-Thalassemia Major,β-TM)患儿心理行为问题及其影响因素,旨在为患儿制定科学合理的早期心理行为干预提供参考依据。方法:(1)第一部分:质性研究法,采用目的抽样法选取2021年5月～2021年7月,在广西百色市某三甲医院进行治疗的14名β-TM患儿父母作为研究对象,开展一对一半结构式深入访谈,应用Colaizzi的现象学分析法进行资料整理分析,从父母的角度探讨β-TM患儿心理行为问题现状。(2)第二部分:横断面研究方法,采用整群抽样法选取2021年8月～2022年8月,在百色市3家三级甲等医院住院治疗、符合纳入及排除标准的240名β-TM患儿父母为研究对象进行调查。采用一般资料调查问卷、conners父母用症状问卷(Parent Symptom Questionnaire,PSQ)、焦虑自评量表(Self-rating Anxiety Scale,SAS)、抑郁自评量表(Self-rating Depression Scale,SDS)、简易应对方式问卷(Simplified Coping Style Questionnaire,SCSQ)、父母教养方式量表父母版(Egna Minnen Betrafande Uppfostran-Parents,EMBU-P)分别调查患儿及父母一般人口学资料,患儿心理行为问题,父母负性情绪、应对方式、教养方式,以上问卷均由患儿父母填写。采用SPSS 24.0对调查所得数据资料进行统计描述、单因素分析、相关分析、多因素回归分析,以α=0.05为检验水准。结果:(1)质性研究结果,父母对β-TM患儿心理行为问题现状描述总结出3个主题:(1)β-TM患儿存在明显心理行为问题;(2)父母担心患儿身心健康及未来发展;(3)期望获得更多医疗与社会支持。(2)量性研究结果:(1)描述统计分析显示:β-TM患儿心理行为问题总得分为53.84±10.34分,有30.00%患儿被检出存在心理行为问题。β-TM患儿父母焦虑检出率55.00%,抑郁检出率47.92%。β-TM患儿父母消极应对占比29.58%。β-TM患儿父母教养方式的拒绝、情感温暖、过分保护三个维度占比分别为26.25%、35.42%、38.33%。(2)单因素分析结果显示,患儿性别、年龄、是否是独生子女、确诊后是否立即治疗、是否规律除铁、是否觉得影响学业、父母受教育程度、家庭情况、家庭收入、疾病经济负担重的β-TM患儿的心理行为问题差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)相关分析表明:β-TM患儿的心理行为问题与父母焦虑、抑郁、拒绝、过分保护的教养方式、消极应对方式呈正相关(r=0.629、0.836、0.770、0.517、0.504,P<0.05)、与父母积极的应对方式、情感温暖的教养方式呈负相关(r=-0.689、r=-0.503,P<0.05)。(4)多因素Logistic回归分析显示:患儿性别、年龄、家庭情况、是否规律除铁、母亲受教育水平、家庭经济水平、疾病经济负担、父母焦虑、抑郁、应对方式、教养方式共11个因素是桂西地区β-TM患儿心理行为问题发生的主要影响因素。结论:(1)质性与量性研究结果均表明桂西地区β-TM患儿心理行为问题均较为突出,检出率较高,急需解决。(2)桂西地区β-TM患儿心理行为问题与父母焦虑、抑郁、应对方式及教养方式密切相关。(3)桂西地区β-TM患儿心理行为问题受患儿性别、年龄、未规律除铁、家庭情况、母亲受教育水平、家庭经济水平、疾病经济负担、父母焦虑、抑郁、应对方式及教养方式因素影响。

关键词： 糖代谢异常   铁过载   胰岛素抵抗指数   糖化血红蛋白HbAc1   重型β地中海贫  

摘要： 目的:了解本地区重型β地中海贫血铁过载患者血糖及糖代谢异常情况及探讨可能的发病机制。方法:研究对象共收集2015年01月01日至2022年10月01日期间在右江民族医学院附属医院经地中海贫血基因检测诊断为重型β地中海贫血患者102例,测定其血清铁蛋白(Serum Ferritin,SF)、空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)、糖负荷后2h血糖,空腹胰岛素(Fasting Serum Insulin,FINS)、糖化血红蛋白(Glycated Hemoglobin,HbAc1)等指标。通过公式计算出胰岛素抵抗指数(Homa Insulin Resistance Index,HOMA-IR)、胰岛β细胞功能指数(Homeostatic Model of Membrane Island Beta Cell Function,HOMA-β)。研究对象按年龄构成分为4组:0～岁组,5～岁组,10～岁组,18及以上岁组。按血清铁蛋白浓度分组:SF<2500μg/L组;2500μg/L≤SF<5000μg/L组;SF≥5000μg/L组。其中39名重型地中海贫血患者再根据是否发生糖代谢异常分为重型β地中海贫血未发生糖代谢异常和重型β地中海贫血发生糖代谢异常组。对各分组间血糖相关临床指标进行比较。采用K个独立样本非参数检验及两两比较比较各组间各临床指标之间的差异。采用pearson correlation相关分析血清铁蛋白(SF)与血糖相关临床指标之间的相关分析。采用多重线性逐步回归分析评估血糖相关临床指标对SF的影响,并建立回归方程。结果:(1)102名重型地中海贫血患者不同年龄分组间性别、SF、空腹血糖的比较差异无统计学意义(P>0.05);不同SF分组间年龄、性别的比较差异无统计意义(P>0.05),不同SF分组间空腹血糖的比较差异无统计意义(P<0.001)。SF≥5000组与SF<2500组、2500≤SF<5000组间空腹血糖比较均有统计统计学意义(P<0.001).SF≥5000组空腹血糖(7.45mmol/L)大于SF<2500组空腹血糖(5.29mmol/L)。2500≤SF<5000组与SF≥5000组比较差异有统计学意义(P<0.05),SF≥5000组空腹血糖(7.45mmol/L)大于2500≤SF<5000组空腹血糖(6.20mmol/L)。(2)39例患者中,发生糖代谢异常33例(84.6%占总体人数的32.4%),其中糖耐量减低26例(66.6%,占总体人数的25.5%),糖尿病6例(15.4%占总体人数的5.9%)。重型β地中海贫血患者糖代谢异常的发病率随着血清铁蛋白浓度逐渐升高,2500μg/L≤SF<5000μg/L时糖代谢异常患病率为75%,占总体人数的11.8%;SF≥5000μg/L时糖代谢异常患病率为95.2%,占总体人数的19.6%,其中糖尿病患病率为28.5%,占总体人数的5.9%。(3)重型β地中海贫血患者的糖化血红蛋白(HbAc1)并不能很好的反应患者的糖代谢状态,常规切点糖化血红蛋白(HbAc1)≥6.5%对各年龄组及各血清铁蛋白分组糖代谢异常的检出率均不高。(4)在血清铁蛋白浓度逐渐升高的情况下,各组间空腹血糖、胰岛素抵抗指数、胰岛细胞功能指数比较差异有统计学意义(P>0.05)。SF≥5000 ug/L组空腹血糖(6.07 mmol/L)高于2500 ug/L≤SF<5000 ug/L组空腹血糖(4.58 mmol/L);SF≥5000 ug/L组胰岛素抵抗指数(3.33)高于2500 ug/L≤SF<5000 ug/L组胰岛素抵抗指数(2.60);2500 ug/L≤SF<5000 ug/L组胰岛细胞功能指数(208.58)高于SF≥5000ug/L组胰岛细胞功能指数(72.56)。而各组间年龄、糖负荷后2h血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05),但糖负荷后2h血糖、空腹胰岛素的值在组间呈逐渐增高趋势。(5)血清铁蛋白(SF)与空腹血糖、糖负荷后2h血糖、胰岛素抵抗指数呈正相关,相关程度都达统计学意义(P<0.01),与胰岛细胞功能指数呈负相关,相关程度达统计学意义(P<0.01)。结论:(1)重型β地中海贫血铁过载患者发生血糖代谢异常风险偏高,发生率随着铁过载程度逐渐升高,需提高临床重视。(2)重型β地中海贫血铁过载患者糖代谢异常的潜在机制可能与铁过载导致胰岛素抵抗及胰岛素分泌功能的下降相关。

关键词： 克罗恩病   地中海贫血   临床特征   全外显子测序  

摘要： 目的:克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是由免疫、环境、微生物等因素在遗传易感个体上组合所引起的肠道炎症性疾病,地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病。临床上CD合并地中海贫血患者少见,目前国内外相关研究较少。本研究旨在分析CD合并地中海贫血患者的临床特征、鉴定其致病基因位点,为CD合并地中海贫血研究提供可参考的临床和基因资料。方法:1、回顾性纳入2016年1月-2021年1月于中南大学湘雅医院门诊及住院部就诊新确诊的CD患者。根据CD患者是否合并贫血分为CD非贫血组与CD贫血组。在CD贫血组中去除未进行地中海贫血筛查或基因诊断的患者后,再根据是否合并地中海贫血分为CD非地中海贫血组与CD地中海贫血组。基于完全随机设计下重复测量的方差分析研究,最终纳入48例CD患者,包括CD非贫血组16例,CD非地中海贫血组16例,CD地中海贫血组16例。收集所有患者的一般资料及确诊时基线第0周、治疗后第14周、治疗后第52周的临床资料、实验室检查结果及内镜资料。比较三组患者的基线临床特征及对药物治疗的反应。2、提取11例CD地中海贫血组患者的外周血基因组DNA,采用全外显子测序技术进行基因测序,经数据筛选及生物信息学分析过滤得到致病基因及位点,使用Sanger测序验证患者CD和地中海贫血的致病位点。结果:1、(1)CD非贫血组、CD非地中海贫血组及CD地中海贫血组基线时的男女比例、吸烟人数、合并肛周病变人数存在差异,差异有统计学意义(P<0.05)。CD非地中海贫血组与CD地中海贫血组的贫血均为轻中度小细胞低色素性贫血,两组贫血程度无统计学差异(P=1.000)。CD地中海贫血组的平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白量、低密度脂蛋白水平显著低于其他两组患者(P<0.05),红细胞分布宽度水平显著高于其他两组患者(P<0.001)。(2)CD地中海贫血组患者中分别有43.8%、46.7%、57.1%的患者在基线、治疗后第14周、治疗后第52周处于临床缓解期,与其他两组患者无明显差异(P>0.05)。(3)CD地中海贫血组患者的血红蛋白与CD非地中海贫血组相比,在基线(P>0.05)、治疗后第14周无明显差异(P>0.05),在第52周时两组差异具有统计学意义(P=0.045)。2、(1)CD合并地中海贫血患者中已知IBD致病基因检测阳性率为90.9%(10/11)。在已检出的IBD致病基因中,自身免疫性疾病相关基因检出率最高,达42.9%(9/21),包括STXBP2、HPS6、MANBA、TYK2、IL6ST、TNFAIP3、UBA7、TNFSF18、IL19;上皮屏障功能有关基因检出率为23.8%(5/21),包括IFIH1、NOD2、COL7A1、TTC37、BSN;免疫缺陷相关基因检出率为14.3%(3/21),包括RAG2、DOCK8、LRBA;免疫调节相关基因检出率为4.8%(1/21),仅PLCL1。(2)仅在1例患者中检出β-地中海贫血致病基因条带11p15.5附近的免疫调节相关基因突变,即SIGIRR(c.1031T>G)。结论:1、(1)CD合并地中海贫血患者的低密度脂蛋白水平比其他CD患者低。(2)CD合并地中海贫血患者的平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白量有助于在临床中识别CD合并地中海贫血的患者。2、CD合并地中海贫血患者中已知IBD相关致病基因检出率达90.9%,包括自身免疫性疾病、上皮屏障功能、免疫缺陷等相关基因。图7幅,表15个,参考文献64篇

摘要： 关女士的女儿小梅（化名）于2022年11月被确诊为地中海贫血，该病引起了关女士全家的担心。地中海贫血是一种并不复杂的疾病，但治疗难度较大，花费较多，丝毫不亚于白血病。生活中人们对白血病较为熟悉，但只有较少人知道并了解地中海贫血，因此本文向读者科普地中海贫血相关的知识。

关键词： 恶性疟原虫   地中海贫血   G6PD缺乏   基因诊断   透射电子显微镜  

摘要： 目的:本研究基于既往工作的基础,对云南省傣族人群地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的基因进行诊断,通过恶性疟原虫侵染患有这两种疾病的人以及正常人的红细胞,了解有缺陷的红细胞和正常红细胞之间的原虫侵染情况是否存在差异,以此了解疟疾流行程度与上述疾病的关系。方法:1.采集云南省德宏州盈江县弄璋镇傣族人群的全血样本;2.对全血样本进行地中海贫血的基因诊断、G6PD缺乏症的酶活性检测以及基因突变位点分析;3.使用恶性疟原虫株3D7对患有地中海贫血、G6PD缺乏症疾病的人以及正常人的红细胞进行侵染。4.应用光学显微镜、分析型流式细胞仪、化学发光仪、酶联免疫检测仪对体外培养的疟原虫进行形态学观察、感染率以及疟色素含量的测定。5.应用透射电镜技术对培养过程中的红细胞和疟原虫内部结构变化进行深层次分析,了解它们在微观视野中的变化。结果:1.基因诊断结果:地中海贫血基因诊断结果:52份样本中有地贫患者共28例。其中α-地贫的占比最高,α复合β地贫的占比最少,二者比较有显著差异性(P<0.05,Fisher's exact test)。G6PD缺乏症的基因型、构成比结果:本次样本中,G6PD缺乏症患者共有29例,女性占比高于男性,统计学分析有显著差异性(P<0.0001,Fisher's exact test);G6PD基因突变位点以1311 C>T位点占比最高,和392 G>T位点的占比比较有统计学差异(P<0.01,Fisher's exact test)。2.光学显微镜结果显微镜观察样本血涂片:1)地中海贫血、G6PD缺乏症以及同时具有两种疾病的患者:它们的红细胞在体外培养恶性疟原虫96小时后,观察红细胞外形,大多出现了细胞皱缩、畸形的情况;观察疟原虫生活史红内期发育阶段,疟原虫出现了发育迟缓以及入侵、寄生红细胞困难等问题,导致虫体胞质分散呈现不健康的状态。2)正常红细胞:观察红细胞外形,形态正常,并未出现红细胞淡染区消失或其他特殊形态;观察疟原虫生活史红内期发育阶段,疟原虫发育时期较一致,虫体状态较好。原虫密度的统计学分析:正常人红细胞比地中海贫血、G6PD缺乏症以及同时具有两种疾病的患者红细胞培养的恶性疟原虫的原虫密度高,统计结果均具有显著性差异(P<0.05,One Way ANOVA)。但有缺陷的红细胞培养恶性疟原虫,原虫密度比较没有统计学差异。3.原虫感染率结果:1)流式细胞仪:地中海贫血比G6PD缺乏症、合并两种疾病的的患者红细胞的原虫感染率低,统计学结果具有显著差异(P<0.05,One Way ANOVA)。正常人比地中海贫血、G6PD缺乏症、合并两种疾病的患者的红细胞的原虫感染率高,统计学结果具有显著性差异(P<0.0001,One Way ANOVA)。2)化学发光仪:地中海贫血和G6PD缺乏症、合并两种贫血的患者的红细胞之间比较原虫感染率,结果没有统计学差异。正常人比地中海贫血、G6PD缺乏症、合并两种疾病的患者红细胞的原虫感染率高,统计学结果具有显著性差异(P<0.0001,One Way ANOVA)。以上原虫感染率的比较结果均证明,正常红细胞更容易被疟原虫侵染。4.透射电子显微镜结果:有缺陷的红细胞(地中海贫血和G6PD缺乏症、合并两种贫血的患者的红细胞)培养后多出现外形显著改变,形态奇异,呈不规则形、长尾状等。除了外形多变,胞质内空泡多见且细胞膜表面不完整,有局部或多处崩解。正常人的红细胞电镜下外形规则、大小均一,胞膜完整少有开口。结论:1.云南省傣族人群的样本中,α-地贫比β-地贫的占比高;G6PD缺乏症的5个常见的基因突变位点的类型以1311 C>T为主;2.有缺陷的红细胞在培养恶性疟原虫后多出现红细胞变形以及原虫发育迟缓等问题,而正常人的红细胞培养疟原虫后依旧保持外形正常,且原虫发育不受限。3.正常红细胞相比地中海贫血、G6PD缺乏症患者的红细胞,恶性疟原虫更易侵染。4.电镜下,有缺陷的红细胞在培养后,红细胞外形多变,胞质内出现许多大空泡。