关键词： 地中海贫血   输血规范化   儿童健康   高量输血  

摘要： 1 地中海贫血的发生率和地域分布 地中海贫血(Mediterranean anemia,简称地贫),又称海洋性贫血(thalassemia)、珠蛋白生成障碍性贫血,是由于珠蛋白肽链基因缺陷(突变、缺失等)所致的1种或多种珠蛋白肽链的生物合成降低或完全被抑制,导致珠蛋白肽链间的平衡被破坏,正常成人型血红蛋白(HbA,α_2β_2)合成降低的1种遗传性溶血性贫血;作为人类最常见的单基因遗传病,地贫属常染色体不完全显性遗传.

关键词： 大脑中动脉   α地中海贫血   胎儿   超声多普勒  

摘要： 目的:探讨应用超声多普勒技术测量胎儿大脑中动脉收缩峰期血流速度(middle cerebral artery peak systolic velocity,MCA-PSV)预测胎儿α地中海贫血的价值。方法:对129例具有α地贫风险的胎儿和正常对照组44例胎儿行二维及多普勒超声检查,测量胎儿MCA-PSV并对有地贫风险的胎儿行羊膜腔穿刺或脐血穿刺术进行α地贫基因诊断。MCA-PSV用中位数的倍数(multiples of the median,MOM)表示。结果:重型α地贫胎儿MCA-PSV明显高于中间型α地贫、轻型α地贫和正常胎儿,差异有统计学意义(P<0.001)。MCA-PSV预测胎儿重型α地贫的最佳临界点为1.29MOM,MCA-PSV>1.29MOM预测胎儿重型α地贫的灵敏度、特异度分别为81.25%、93.62%;重型α地贫胎儿MCA-PSV异常增高最早于孕16周出现。结论:超声多普勒测量胎儿MCA-PSV可作为预测胎儿重型α地贫的一种非侵入性方法,预测胎儿重型α地贫的灵敏度、特异度较高,可减少不必要的侵入性操作。

关键词： 地中海贫血   基因检测   血红蛋白电泳  

摘要： 地中海贫血(地贫)是由于基因缺失或突变导致的珠蛋白合成障碍的一组遗传性溶血性贫血,其临床表现差异较大,轻者可无任何症状,重者可在胎儿期死于宫内或出生后几年夭折,个别重型患者终生依赖输血维持生命,给家庭和社会带来一定的负担.为了解本地区地贫的发生情况和基因分布,作者对11 565例地中海贫血检测的筛查及基因诊断结果进行分析.

关键词： 地中海贫血   基因携带率   基因型分析   流行病学  

摘要： 目的:调查佛山市新婚人群中α地中海贫血(简称α-地贫)的基因携带率、基因突变类型及其分布特征。方法:采集佛山市南海区35 980例新婚育龄人群外周静脉血。以平均红细胞体积(MCV)<80f1为血液学表型初筛阳性指标。对其中3 003例表型阳性和1 749例表型阴性样品进行3种常见缺失型α-地贫基因型分析。结果:育龄人群中常见α-地贫基因携带率为8.85%;检出常见α-地贫基因型频率依次为5.431%(--SEA/αα)、2.475%(-α3.7/αα)、0.807%(-α4.2/αα);常见α-地贫基因的基因频率依次为2.76%(--SEA/)、1.31%(-α3.7/)、0.43%(-α4.2/);常见α-地贫临床类型的发生率依次为3.28%(静止型α-地贫)、5.48%(标准型α-地贫)、0.09%(血红蛋白H病)。结论:本文总结了佛山市新婚育龄人群中α-地贫的基因携带率、基因突变类型及其分布特征等分子流行病学资料,为开展优生工作和制定α-地贫预防计划提供基础资料。

关键词： 溶血指数   红细胞脆性试验   β-地中海贫血   筛查  

摘要： 目的建立一种操作简单的红细胞脆性试验定量方法。方法对红细胞脆性正常40例为对照组和经基因检测确诊为β-地中海贫血40例为实验组进行红细胞脆性实验,30min后用日立7171A测溶血指数。并取第四管作为指标管,来判断红细胞脆性。结果30min后测定第1至6管的溶血指数(x-±s),实验组与对照组比较,各同一编号管差异有显著性(P<0.01)。对照组1与2、2与3、3与4、4与5管、5与6管相邻两管的溶血指数比较t分别等于18.41、20.54、23.24、14.27、13、69,P均≤0.01,差异均有显著性,其中3与4、4与5、5与6管比较,t值较大、数据相差也较大。结论日立7170A全自动生化分析仪上提供的血清信息功能中的溶血指数可以用来反映红细胞的脆性高低,选择经典方法第四管的溶血指数(一管定量法)作为指标管,操作非常简便,结果量化,快速、成本低廉,适用于临床对地贫的快速筛查。

关键词： 拉曼光镊   微流控芯片   流式细胞仪   β地中海贫血  

摘要： 为自动检测和分析地中海贫血(地贫)红细胞内部的物质变化情况,建立拉曼光镊-微流控芯片自动化系统平台。应用此装置收集β地贫红细胞和正常红细胞的拉曼光谱,并对其进行多元统计分析,从拉曼特征峰(1004,1130,1450,1545,1604和1618cm-1)的数据统计分析可见,β地贫红细胞的血红蛋白分布比正常红细胞广,平均强度差在6%以内。采用主成分分析法,可较好地将正常红细胞和β地贫的红细胞区分开,从载荷图可以更明显的看到它们的变化情况。此装置实现了快速、准确、非损伤的全自动化检测,为生物学的研究和医学诊断提供新的研究手段。

关键词： β珠蛋白   腺相关病毒   重型地中海贫血   胎儿造血细胞   高压液相色谱  

摘要： 目的： β地中海贫血是β-珠蛋白基因调控区域或编码序列的缺失或突变导致p-珠蛋白链合成障碍,而引起的慢性溶血性疾病。该病为世界上发病率最高的单基因遗传病之一,目前尚无疗效满意的治疗方法。β地中海贫血的基因治疗策略为通过载体介导正常β-珠蛋白基因转移入地贫患者造血干细胞内,增加红系细胞中正常β-珠蛋白链合成,重建α链与β链之间的平衡,达到长期缓解或治愈β地贫的目的。本室早期实验已证实AAV载体能介导人β-珠蛋白基因长期稳定表达于地贫小鼠和正常人的造血细胞中。在此基础上,本课题拟通过ex vivo途径,以AAV病毒转染来源于重型β地贫流产胎儿的造血细胞,检测其介导的β珠蛋白基因的体内表达,进一步探讨AAV载体应用于β地中海贫血基因治疗的可行性。 方法与结果： 1.获取携带人β-珠蛋白基因的重组腺相关病毒载体 酶切鉴定克隆有miniLCR和β-globin结构基因的pMT-2质粒,然后采用磷酸钙共沉淀法将三质粒pMT-2, pAAV-RC, pHelper共转染HEK293细胞,包装含有人β-珠蛋白基因的rAAV2-β-globin病毒；通过肝素亲和层析法纯化制备重组AAV2载体；斑点杂交法(dot-blot)和SDS-PAGE蛋白电泳检测表明获得高纯度的滴度为1010vg/ml级别的rAAV2-β-globin病毒。 2.携带人β-珠蛋白基因的rAAV2载体在MEL中的表达 以rAAV2病毒体外转染MEL细胞,PCR、RT-PCR结果显示MEL细胞本身并不存在人β-珠蛋白基因,AAV载体可介导外源性人p-珠蛋白基因转移入MEL细胞中并获得表达。说明rAAV2病毒载体在体外可有效转染红系细胞并介导珠蛋白转基因在其中的表达。 ***2介导人β-珠蛋白基因转导纯合子型重型β地中海贫血胎儿造血细胞 在体外实验的基础上,我们分离了1例诊断明确的β41-42纯合子型重型β地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=10)后移植入经环磷酰胺预处理的4只BALB/c裸小鼠体内。等位基因特异性PCR结果表明,移植后14d受体鼠体内除检测到突变的β41-42基因表达外,同时可检测到AAV载体介导的正常人β-珠蛋白基因表达,且该表达至少可持续至移植后27d。提示AAV可有效转染纯合子型地中海贫血患者的造血细胞,并通过ex vivo途径介导β-珠蛋白转基因在小鼠体内的表达。 ***2介导人β-珠蛋白基因转导杂合子型重型β地中海贫血胎儿造血细胞 为进一步研究AAV载体对于临床上更为常见和复杂的杂合子型地贫患者的转染效率,在纯合子型流产地贫胎儿实验基础上,我们继续分离了5例杂合子型p地贫流产胎儿造血细胞,其基因型依次为：β41-42/β71-72型,β654/缺失型,β41-42/β654型,β41-42/βE型及β41～42/β645型。胎儿造血细胞经rAAV病毒转染(M0I=10或50)后输入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,于移植后不同时间点处死小鼠,检测体内人β-珠蛋白基因的表达。结果发现,小鼠骨髓及外周血中均能检测到人p-actin基因表达,提示胎儿造血细胞的成功植入。等位基因特异性PCR分析发现,在10MOI转染的β654/缺失型胎儿样本中,由于有限的转基因表达水平以及β654突变基因所表达的正常β-珠蛋白基因的干扰,无法准确检测出AAV载体介导的正常β-珠蛋白基因表达,但在其余4例样本中,均明确检测到AAV介导的外源性β-珠蛋白基因表达,且该表达至少可持续至移植后70d。此外,我们用高灵敏度的HPLC方法检测了β-珠蛋白基因在小鼠外周血人红系细胞中的表达,结果显示AAV载体在10MOI与50MOI两个感染复数下均可增加红系细胞中人β-珠蛋白肽链的合成,且50MOI转染组的转染效率和转基因表达稳定性均明显高于10MOI组。 结论： 本研究表明AAV病毒载体可有效转染来源于重型β地中海贫血流产胎儿的造血细胞,经AAV转染后的造血细胞在BALB/c裸小鼠体内可获得正常人β-珠蛋白转基因的长期、稳定表达,以及外周血人红系细胞内β-珠蛋白肽链的合成增加。

关键词： 胎儿   α-地中海贫血   大脑中动脉峰值流速   超声  

摘要： 目的探讨超声检测胎儿大脑中动脉血流峰值流速(MCA-PSV)对产前预测重型α-地中海贫血的价值。方法超声检测399例不同孕龄胎儿MCA-PSV,显著升高(高于同孕龄胎儿中位数的1.5倍)者行脐静脉穿刺及基因诊断。结果 16例胎儿MCA-PSV显著升高,其中重型α-地中海贫血胎儿12例,重型β-地中海贫血1例,胎儿多发畸形并梅毒感染1例,假阳性2例。重度贫血胎儿MCA-PSV较同孕龄正常对照组胎儿MCA-PSV明显增高,两组差异有统计学意义(P<0.001)。以MCA-PSV高于同孕龄胎儿中位数的1.5倍为标准,超声预测重度胎儿贫血的敏感性为100%,假阳性为12.5%。结论超声检测MCA-PSV是产前预测胎儿重型α-地中海贫血的有效方法。

关键词： 重型地中海贫血   造血干细胞   移植   骨髓   外周血   脐带血  

摘要： 研究背景：地中海贫血（简称地贫,thalassemia）,也称为海洋性贫血或库勒氏贫血,是世界上最常见的遗传性血液病之一。地中海贫血是其中一组对人类健康影响最大的溶血性血液病,因该病最早发现的病例为地中海沿岸地区的人而得名,其分子基础为珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成障碍,使形成血红蛋白四聚体的α-链/非α-链比例失衡,进而引起红细胞破坏而溶血。我国的高发区主要分布于长江以南各省区,人群中α地贫基因携带者检出率约为1-23%,p-地贫为0.5-6%,其中,尤以广西、广东和海南三省（区）为甚。 地中海贫血是一种进展性疾病,虽然可以给予红细胞输注及去铁治疗,但这一疾病最终还是导致病人早期死亡。死因一是慢性贫血及其并发症,二是死于未适当地使用铁鳌合剂而导致的铁沉积病。目前使用的常规治疗方法主要包含二个方面：一是输血。每10-30天1次,以纠正他们所患的严重贫血,使血红蛋白（Hb）维持在90-120g/L,长期连续地输血导致体内大量铁的沉积,特别对身体的器官如心脏、肝脏和内分泌系统带来损伤;二是正确使用铁鳌合剂。在中国,1名重型地中海贫血患者,如果接受正规输血及去铁治疗,每年的费用在5万元以上。尽管没有确切的统计数据,但临床实践表明,在中国大部分的地贫儿童在生命前十年内死亡,其余的儿童在第二个十年内死亡,能够活至20岁以上重型地贫儿童很少,目前这些病人因经济原因绝大多数得不到有效治疗而在15岁前死亡;广东省总病人数现估计在3000人左右。随着生活水平的提高,接受正规或不正规输血替代治疗的病孩逐渐增多,生存期有所提高,全省总病人数也在增加。这种经历十几年的折磨,最终的残酷结局,对每个地贫病人家庭和社会在精神上和经济上都是沉重的打击。即使给予正规的输血加去铁治疗也常于30岁之前夭折。可见,β重型地贫病人给社会和家庭造成严重的危害,对构建和谐社会和提高人口质量构成严重威胁。 自Thomas和他的同事于1982年首先报道了第一例成功的同胞骨髓移植治疗地贫病例以来,异基因造血干细胞移植（HSCT）开始被用于治愈地贫;异基因HSCT是根治重型地贫唯一的治疗模式,这一治疗策略已经被医学界所普遍接受。因为HSCT是通过克服受者免疫屏障,将供者干细胞作为基因载体植入受者体内替代造血,纠正受者基因缺陷,因此HSCT实际上是一种基因治疗。造血干细胞移植治疗后的地中海贫血患者的生活质量明显高于传统输血及去铁治疗的患者。对有HLA相合同胞供者的重型β-地贫患者来说,造血干细胞移植应作为首选治疗。骨髓移植的效果与患者年龄、身体状况、预处理方案、供者来源、HLA相合程度及对并发症的处理等因素密切相关。 目前在造血干细胞移植治疗地贫方面备受研究者关注的是造血干细胞的来源问题。人类白细胞抗原（HLA）全相合同胞供髓骨髓移植治疗重型β地贫,国外已相当成熟,但由于我国实行计划生育政策,HLA全相合的同胞骨髓来源显得异常困难,绝大部分重型β地贫病人无HLA全相合同胞供者。因此,人们不得不尝试应用其他来源的造血干细胞进行移植。 中国地贫移植研究起步晚,移植的病例不多，患者去铁的情况多不正规（港台地区除外）,病人的状况较差,而医疗卫生资源相当有限,需要探索出一条符合中国特色的重型地中海贫血造血干细胞移植的可行之路。本课题主要就不同来源造血干细胞移植方法,不同状态儿童移植效果的差异性,移植物抗宿主病防治方案,移植相关并发症如感染、出血性膀胱炎、肝静脉闭塞病的防治等问题进行研究。 我们自90年代末以来,即开始探索造血干细胞移植治疗地中海贫血,近几年来,不断改进治疗方案,进行新的探索,本文将我中心自2005年1月以来至2009年12月共5年所做的地贫93例共97次造血干细胞移植进行回顾性总结,报告如下。 研究对象与方法：地贫患儿93例,男68例,女25例;中位年龄7岁（0.7岁-12岁）;单次移植89例,二次移植4例。 根据国内地贫患儿年龄、肝大情况和铁蛋白水平,将重型地中海贫血分为低危（17例）、中危（46例）、高危（30例）,大体相当于Pesaro地贫分度标准的Ⅰ度、Ⅱ度和Ⅲ度。 为了抑制和减轻患儿骨髓高增殖状态,减轻预处理的负担,增加植入的机会和减少移植后排斥,患儿移植前45天（40-60天）开始,给患儿口服羟基脲（hydroxyurea,30mg/kg.d）和硫唑嘌呤（azathioprine,3mg/kg.d）。 预处理方案。环磷酸胺（cyclophosphaminde,CY）:剂量100-120mg/kg,分2天静脉滴注（-10d--9d）。白消安（Busulfan,BU）:剂量9.6-17.6mg/kg,分3-4天静脉注射（-8d--5d,或-8d--6d）。年龄越小,单位体重使用B

关键词： 地中海贫血筛查   FTIR/ATR光谱   Savitzky-Golay平滑   移动窗口PLS   等间隔组合移动窗口MLR  

摘要： 地中海贫血是危害极为严重的单基因遗传病,在我国广西、广东等南方地区具有较高发病率,目前尚无有效的治疗手段,地贫筛查是防止地贫症患儿出现的主要预防手段。血红蛋白浓度(HGB)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞体积(MCV)是其中主要指标,但现有测定方法需要对不同指标用不同的化学试剂进行化学反应,不利于大人群筛查。本课题采用傅立叶变换红外光谱(FTIR)结合衰减全反射(ATR)技术,建立无需化学试剂、精度适中、直接快速同时测定上述指标的定量分析方法。 首先随机抽取部分全血样品分别加入蒸馏水,溶为2倍、3倍、4倍、5倍、6倍的溶血样品,连同全血样品一起共得到6个样品组,分别进行FTIR/ATR光谱实验,探讨利用FTIR/ATR光谱分析HGB、MCH、MCV等指标可行性和样品的光谱测定方法。经分析,确定采用2倍溶血的形式测定样品,然后对其余的全部样品进行FTIR/ATR光谱测定实验。采用光谱数据结合常规测定方法得到的HGB、MCH、MCV的参考值(化学值)分别建立各指标的光谱定标预测模型。基于定标集和预测集的不同划分,分别采用单波数回归、直接偏最小二乘法(PLS)、基于Savitzky-Golay (SG)平滑的PLS、移动窗口PLS(MWPLS)和等间隔组合移动窗口MLR (ECMWMLR)等方法系统深入的进行光谱预处理模式的优选、分析波段(或波数组合)的选择,模型的稳定性分析等,最后对优选的模型进行再次检验。 主要结果如下： 1)考虑到定标集和预测集的不同划分会造成模型预测效果的波动,为了得到稳定可靠的结果,本文提出了一种新的定标和预测集的划分方法,并构建计算机算法平台将全体样品做50次定标和预测集的划分,计算50次不同划分的模型预测均方根偏差(RMSEP)和预测相关系数(RP)的平均值(RMSEPAve、RP,Ave)等,然后基于RMSEPAve优选稳定可靠的模型； 2)把SG平滑模式由原来的117个扩充为540个,将全部540个SG平滑模式与PLS模型结合,构建基于SG平滑的PLS算法平台,可以大范围同时优选SG平滑模式与PLS因子数。HGB、MCH、MCV三个指标的全谱模型结果都表明,其最优SG-PLS模型的预测效果明显优于直接PLS模型的预测效果,并且筛选出的SG平滑模式和PLS因子数是稳定的,从而建立了一种有效的光谱预处理模式筛选方法； 3) MWPLS方法是著名的光谱分析波段的优选方法,但是本文发现基于定标集和预测集的不同划分,MWPLS方法的最优波段会变化,为了得到稳定的结果,本文基于50次不同划分分别建立MWPLS模型,按照RMSEPAve优选最优波段,同时得到稳定可靠的模型。这里还编写了起点波数(B)、采用波数点数(N)和PLS因子数(F)都任意可变的MWPLS算法程序平台,并设置合理的参数范围,使得筛选的最优波段达到全局最优。其中,HGB、MCH和MCV的最优MWPLS模型参数(B,N,F)分别为(1178cm-1,12,2)、(1549cm-1,9,6)和(3098cm-1,310,5),它们的(RMSEPAve, RP,Ave)分别为(5.334g/L,0.968)、(1.794pg,0.910)和(4.299fl,0.869),明显优于全谱的最优PLS模型,并且采用的波数点个数很少,大大的降低了模型的复杂性。 4)采用本课题组新近提出的ECMWMLR方法分别建立HGB、MCH和MCV的最优等间隔离散模型,构建了起点波数(B)、采用波数点数(N)和采用波数点的间隔(G)都任意可变的ECMWMLR算法平台,并设置合理的参数范围,使得筛选的最优波数组合达到等间隔的全局最优。其中,HGB、MCH和MCV的最优ECMWMLR模型参数(B,N,G)分别为(1952cm-1,4,68)、(3568cm-1,8,69)和(3964cm-1,13,109),它们的(RMSEPAve，RP,Ave)分别为(5.036g/L,0.972)、(1.662pg,0.919)和(3.929fl,0.892)。最优ECMWMLR模型的预测效果比最优MWPLS模型还要好一些,它克服了光谱的共线性,同时还保留MLR的简单性,比MWPLS方法更进一步降低了模型的复杂性。 本文率先建立了基于FTIR/ATR光谱的地贫筛查指标HGB、MCH和MCV的同时定量分析方法,并进行了模型优选和稳定性分析,该方法具有精度适中、直接快速的优点。基于MWPLS、ECMWMLR方法得到的最优波段、最优波数组合分别为连续型、离散型的小型专用红外光谱仪器的高信噪比分光系统的设计提供重要依据,也为FTIR/ATR应用于人体血液地贫筛查指标的同时定量分析提供稳定可靠的模型。论文所提出的系统方法也能够应