关键词： 重型地中海贫血   儿童   造血干细胞移植   免疫重建  

摘要： 异基因造血干细胞移植（allogenic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）仍然是治愈遗传性血红蛋白病如重型β地中海贫血（Thalassemia Major,TM）患儿的唯一手段,但其临床应用受到以下因素的限制,如预处理的相关毒性,供者细胞对受者细胞抗原的免疫反应引起的移植物抗宿主病（graft versus host disease,GVHD）及延迟的免疫重建或免疫缺陷导致感染,复发及偶尔的排斥等等。造血干细胞移植后的免疫重建在成人已有较为深入的研究,但对于儿童研究很少。经过大剂量的化疗后,受者免疫细胞的大量减少,但受者浆细胞往往可能持续存在至移植后数月到数年。移植前许多因素也可影响移植后的免疫状态及其恢复,如年龄,干细胞来源,组织相容性抗原（histocompatibility antigen,HLA）相合的程度等等。移植后的急性GVHD,巨细胞病毒感染（cytomegalovirus,CMV）,免疫抑制剂应用、抗菌素,免疫球蛋白的应用及供者的淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusions,DLI）等均可影响移植后免疫的恢复。提高移植后的免疫重建是决定其临床治疗效果的重要因素。我们研究在TM的儿童在清髓性的allo-HSCT后2年内的T细胞亚群及体液免疫的恢复及其相关影响因素。 本课题旨在探讨TM儿童在异基因外周血造血干细胞移植后2年内的免疫恢复情况,评估CMV感染对T细胞亚群的影响,评估不同的供者年龄和受者年龄对体液免疫的恢复的影响,从而评估免疫细胞在造血干细胞移植中可能的作用,期望通过该研究为移植后免疫重建的快速恢复,减少移植后感染死亡提供指导意义。 我们回顾性的分析在南方医科大学南方医院儿科层流病房进行外周血造血干细胞移植的地贫患儿免疫恢复情况。第一部分移植后T细胞亚群的研究对象和方法第一节：移植后半年的T细胞亚群的研究对象和方法 1.1)对于半年内的T细胞亚群的研究对象,入选研究范围的标准是：2009年3月至2011年6月内所有在我中心的地中海贫血患儿行非亲缘外周血造血干细胞移植的对象,在移植后半年的随访期间内未发生死亡或排斥,半年时完成T细胞亚群8项（包括CD3+、CD4+、CD8+、NK、CD4+CD45RA+、CD4+CD29+、 CD8+CD28+、CD8+CD28-这八项）和血常规的评估,移植后截止于2012年1月仍无病存活的病例。共有40例患儿,其中CMV感染有20例。评估其免疫恢复情况和CMV对其的影响。 1.2)预处理方案 患儿均给予清髓性的预处理方案,包括环磷酰胺（cyclosphosphamide,Cy）100-120mg/kg,d-10至d-9分两天静脉滴注,氟达拉滨（fludarabine,Flu）,200mg/m2,-6至-2天分5天静脉滴注,塞替哌（thiotepa,TT）,10mg/kg,-5天1天分两次静脉滴注,白消安（buslfan, BU）,9.6-17.6mg/kg,分3-4天静脉注射（-8至-6天）。所有患儿给予环孢素A（cyclosporine A）,霉酚酸酯（mycophenolate mofetil, MMF）和ATG（-3—-1天）预防GVHD。短疗程的甲氨蝶呤（methotrexate、MTX）在移植后第1,3,6天分别给予15,10and10mg/m2治疗。肝素钠预防肝静脉阻塞综合症（hepatic veno-occlusive disease,VOD）。 1.3)移植前及移植后检测及预防巨细胞病毒定量 移植前常规进行更昔洛韦（10mg/kg）治疗,疗程8-10天。在allo-HSCT后中性粒细胞数＞0.5×109/L开始每周监测CMV-DNA复制数,直到100天,移植后1月开始,常规进行每月7天的或每2月10天的预防性更昔洛韦治疗。CMV感染定义为在外周血中可监测到病毒的复制数,即＞500/ul。更昔洛韦的剂量或改用磷甲酸钠会依据患儿的肾功能和外周血中性粒细胞数进行调整,如外周血中性粒细胞数连续2天小于0.5×109/L停止更昔洛韦。 1.4)植入的标准：移植后28天,第二个月,适当时甚至更长时间的检测植入证据。 间接指标：移植后临床存活21天;各系统造血恢复正常,包括红系,粒系,淋巴系,巨核系等,中性粒细胞数在0.5×109/L,血小板数维持在20×109/L;临床上出现GVHD。肿大的肝脾回缩至正常大小;乳酸脱氢酶降至正常水平。 直接指标：供受者性别不同采用免疫荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测性染色体的转变,供受者性别相同采用短串联重复序列（va

关键词： 重型β地中海贫血   ELISA   HGV   TTV   广西  

摘要： 目的：调查TTV，HGV在118例广西重型β地中海贫血患者中的感染率及分布特征。 方法：随机收集广西各个地区的重型β地中海贫血患者血清共118例，其中男74例，女44例，年龄2—25岁，输血总量8—960U。采集这些患者血清，以ELISA法检测血清中的TTV及HGV。根据患者的性别，年龄，输血量，居住地进行分组，分别计算各组TTV及HGV的感染率。 结果：1.118例广西重型β地中海贫血患者TTV阳性4例，感染率为3.39%。根据患者年龄分为<10岁组和>10岁组，TTV阳性例数均为2例，阳性率分别为2.25%，6.90%（P>0.05）；在性别组中，男性组和女性组的阳性例数分别是3例和1例，对应的阳性率为4.05%，2.27%（P>0.05）；而居住在桂北的TTV阳性例数为3例，桂南的阳性例数为1例，阳性率分别为6.52%，1.39%（P>0.05）；在输血量(<20U，20-100U，>100U)组中，TTV的阳性例数依次为2例，1例，1例，对应的阳性率为7.41%，1.85%，2.70%（P>0.05）。 2.118例广西重型β地中海贫血患者HGV阳性8例，感染率为6.78%。根据患者年龄分为<10岁组和>10岁组，HGV阳性例数分别为7例和1例，阳性率分别为7.87%，3.45%（P>0.05）；在性别组中，男性组和女性组的阳性例数分别是5例和3例，对应的阳性率为6.76%，6.82%（P>0.05）；而居住在桂北的TTV阳性例数为7例，桂南的阳性例数为1例，阳性率分别为15.22%，1.39%（P<0.05）；在输血量(<20U，20-100U，>100U)组中，HGV的阳性例数依次为1例，3例，4例，对应的阳性率为3.70%，5.56%，10.81%（P>0.05）。 结论：1.广西重型地中海贫血患者TTV的感染率为3.39%，感染率低，感染与患者的性别，年龄，输血量，居住地无关。 2.广西重型β地中海贫血患者HGV的感染率为6.78%，感染率低，感染与患者的性别，年龄，输血量无关。

关键词： Bone marrow mesenchymal stem cells   beta thalassemia major   Fourier transform infrared (FTIR) microspectroscopy   cell-to-cell interactions   bone marrow microenvironment   ineffective erythropoiesis  

摘要： Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) are pluripotent cells that can differentiate into a variety of non-hematopoietic tissues. They also maintain healthy heamatopoiesis by providing supportive cellular microenvironment for hematopoietic precursor cells in bone marrow. The present study aimed to investigate global structural and compositional changes in BM-MSCs during beta thalasemia major (beta-TM) using Fourier transform infrared microspectroscopy (FTIRM). Firstly, BM-MSCs were characterized in terms of their morphological, immunophenotypical and differentiation properties. Then, variation in the macromolecular concentrations between studied groups was obtained visually. The significant increase in lipid, protein and nucleic acid concentrations in thalassemic BM-MSCs with respect to the healthy controls were attributed to enhanced cell proliferation and bone marrow activity during ineffective erytropoiesis (IE). The significant decrease in the concentration of the mentioned macromolecules after bone marrow transplantation therapy was interpreted as recovery of IE. Based on their spectral differences healthy control, pre and post-transplant group BM-MSCs were successfully discriminated by hierarchical cluster analysis. This study demonstrated that FTIR imaging can probe interactions between HSCs and MSCs in bone marrow microenvironment rapidly, non-destructively and with minimal experimental preparation procedure by considering the effect of BMT therapy.

关键词： 重型β地中海贫血   γ珠蛋白基因   mRNA表达   Gγ-158多态性   DNA甲基化  

摘要： 目的：本研究通过对广西省重型β地中海贫血患者和正常人外周血中γ珠蛋白基因启动子区片段CpG岛的甲基化位点的确认及其状态检测、γ珠蛋白mRNA的定量表达和“γ-158(C-T)多态性三者的研究,初步筛选出可能影响Y珠蛋白表达的基因启动子区主要的甲基化位点,探讨其甲基化状态、γ珠蛋白mRNA表达与Gγ-158多态性的相关性。 方法：收集广西地区重型β地中海贫血患者和正常健康人外周全血4ml,分别提取标本DNA和RNA。DNA标本用于聚合酶链反应/限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)分析“γ-158多态性；同时采用重亚硫酸盐测序法(Bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)修饰,降落PCR(Touchdown PCR, TD-PCR)扩增,最后对PCR产物进行DNA克隆测序,得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况,定量检测甲基化的确切位置与程度；标本RNA逆转录成cDNA用于实时荧光定量PCR(SYBR GREEN相对定量)检测Y珠蛋白mRNA。 结果：1、87例重型β地贫标本“γ-158位点多态性分析：87例重型β地贫标本检测出10例XmnI杂合子突变,87例正常对照组检测出1例合并XmnI杂合子突变。重型β地贫患者中Gγ-158位点杂合子突变的检出率明显高于正常人11.49％v s1.15％(X2=7.861P=0.009, P<0.05),差异具有统计学意义。 2、30例重型β地贫标本甲基化位点确认：重型β地贫患者与正常人γ珠蛋白基因启动子区均存在4个CG甲基化位点,在序列中分别位于28bp、122bp、231bp、234bp。 3、30例重型β地贫标本甲基化状态检测：重型β地贫患者与正常人γ珠蛋白基因启动子区各CG甲基化位点均呈高度甲基化水平,其中122bp位点甲基化率明显低于正常对照组(X2=10.784,P<0.01)；231bp位点甲基化率低于正常对照组(X2=4.110, P<0.05),28bp和234bp位点甲基化率与正常对照组均无显著性差异(P>0.05) 4、10例合并XmnI重型β地贫标本γ珠蛋白基因mRNA表达检测：合并XmnI重型β地贫与正常对照组γ珠蛋白表达存在显著差异性(Gγ值Z=-3.780P<0.01,Aγ值Z=-2.851P<0.01)差异均有统计学意义。据荧光定量mRNA=2一ΔΔct,以中位数计算Gγ珠蛋白mRNA表达量约为正常对照表达的44倍,Aγ珠蛋白约为正常对照的10倍。 5、10例合并XmnI重型β地贫标本相关性分析：-158位点多态性与mRNA表达相关分析结果示Gγ珠蛋白基因(γ=0.867, P<0.01)、Aγ珠蛋白基因(Y=0.451, P<0.05) mRNA表达与XmnI均呈正性相关；Gγ珠蛋白mRNA表达与γ基因启动子区甲基化率呈负相关(γ=-0.777双侧检验P=0.008, P<0.01), Aγ珠蛋白m RNA表达与γ基因启动子区甲基化率不呈相关(γ=-0.068双侧检验P=0.851,P>0.05)。 结论：重型β地贫患者中“γ-158位点杂合子突变的检出率明显高于正常人；两组研究对象γ基因启动子区均存在甲基化位点且呈高甲基化状态,初步筛选出影响Y珠蛋白表达的主要位点可能在于122bp和231bp；携带“γ-158突变重型β地贫组,γ珠蛋白表达较正常对照组增高且Gγ显于Aγ的增加；重型β地贫患者γ基因启动子区甲基化状态相对正常人较低,Gγ与其呈负性相关。继而证实去甲基化治疗在重型β地贫中的可行性,为进一步研究各种方法和药物(如地西他滨)靶向去甲基化治疗提供基础理论依据,激活γ珠蛋白表达,为重型β地中海贫血的基因治疗带来新曙光。

关键词： α-地中海贫血   东南亚缺失型   疟疾   自然选择  

摘要： 背景与目的 α-地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一。其分子基础是人α-珠蛋白基因发生突变导致对应的珠蛋白链合成不足,使得血红蛋白的α链和非α链比例失衡。目前已知的α-地中海贫血突变以大片段缺失为主,仅有少部分是由于点突变导致的。根据一条染色体上a基因的缺失数目,可分为α0-地中海贫血（--）和α+地中海贫血（-α）两种。α0突变杂合携带者（--/αα）表现出一定程度的贫血症状,而纯合（--/--）则导致严重的致死性疾病,胎儿无法存活。其中,东南亚缺失型（--SEA）是最常见的一种α0突变,其缺失片段内包含了Ψα2, Ψα1,α2,αI和θ基因,全长约为20.5kb。--sEA主要分布在东南亚地区的泰国,菲律宾,越南和中国南部部分地区。前期的流行病调查显示,我国南方的广西和广东地区--SEA突变的携带率分别为7.84%和4.14%。 -SEA突变的区域分布性和其在地区内的高携带率这一现象的产生,一直以来都被认为与其它常见的血红蛋白变异一样,是受到疟疾的自然选择作用。例如,镰刀形贫血症（HbS）、血红蛋白E （HbE）、血红蛋白C （HbC）和β地贫CD41/42突变均从流行病调查数据和/或单倍型分析等方面提供了有说服力的证据。意外的是,对包括--SEA在内的a0-地贫突变与疟疾和自然选择作用之间的关系却一直缺少证据支撑,未见有相关的群体遗传学和分子进化领域方面的报道。随着HapMap, SGVP等群体变异数据计划的完善,以及各种快速低廉的DNA变异分型技术的出现,以基因组上的多态位点信息在群体遗传学水平上探讨自然选择压力在携带特定变异的染色体上留下的印记成为一种方便且可靠的方法。 本研究拟通过对中国南方人群的--SEA缺失突变相关样本的群体遗传学研究,采用基于单倍型分析的方法,检测自然选择压力作用于--SEA缺失在基因组上留下的痕迹,为--SEA是否受到疟疾的自然选择提供证据,以填补该遗传疾病在分子进化研究领域的空白,为其它类似疾病的研究提供一定的参考。 材料与方法 研究样本为来自中国南方广东广西两个地区的214个个体。其中--SEA携带者76人,正常个体138人。由于样本并非按照自然携带率采集,我们通过随机数表,从携带者中选取23人与正常个体一起组成一个携带率为7%的人工随机样本（Constructed Random Samples, CRS）,并且后续的部分分析在两个样本集合中都进行。 研究范围是通过引入HapMap计划中的北京汉族人群（Han Chinese in Beijing, CHB）作为参考确定的。扫描16号染色体的起点至-SEA缺失段下游约300kb范围内的常见单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）,我们筛选出25个标签SNP,另外再加上本实验室前期研究所得到的3个SNP,共28个SNP纳入研究。这28个SNP覆盖的基因组范围约410kb。通过提取样本的外周血DNA,对这些SNP进行分型。步骤如下：先在10-20个的小样本集合中采用测序确定基因型,以此为标准品对大样本使用高分辨率熔解曲线（High-Resolution Melt, HRM）技术进行分型。 分型结果通过Hwsim软件进行哈迪-温伯格平衡检验（Hardy-Weinberg Equilibrium Test, HWE）,该检验使用自由度为1的卡方检验和蒙特卡洛置换检验,检验水准α为0.05。之后使用Phase2.1软件对这28个SNP和--SEA变异位点进行单倍型推断。在推断得到的单倍型基础上做如下分析：首先运用Haploview4.2软件进行连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）分析,计算并绘制连锁不平衡图谱,查看缺失突变与周围多态位点的连锁模式;运用Sweep软件对样本进行长单倍型分析（Long-Range Haplotype Test, LRH test）,检验携带--SEA的染色体是否存在正性选择作用的痕迹,并对-SEA突变出现的时间做粗略的年代估算;运用R软件分别通过bootstrap过程推断突变染色体和正常染色体在研究区段内各个部分的最小重组事件（Minimum Number of Recombination Events, RM）参数,用以判断连锁程度的增加是否来源于大片段缺失引起的缺失段内重组事件消失的影响;最后运用Network4.***.1.0软件对样本单倍型进行了中介网络图构建,用以分析单倍型之间的亲缘关系。 通过上述各个分析结果的综合总结和讨论,可以对-SEA缺失是否受到疟疾的自然选择作用做出一个较有说服力的推测。 结果与讨论 28个SNP位点中,除了一个位点rs216091外（χ2=

关键词： 血常规   缺铁性贫血   地中海贫血  

摘要： 目的:探讨缺铁性贫血和β-地中海贫血的血常规检测结果差异和诊断价值。方法:以t检验法统计分析了β-地中海贫血患者147例、缺铁性贫血患者231例、健康体检正常者150例血常规结果。结果:两贫血组与健康组比较有显著性差异(P<0.05);两贫血组比较,RBC、HGB、MCHC和RDW有显著差异(P<0.05)。结论RBC、RDW对缺铁性贫血和β-地中海贫血的诊断有重要意义。

关键词： α-地中海贫血   荧光片段   基因缺失   多重定量PCR  

摘要： 目的: α-地中海贫血（alpha-thalassemia）是一种常见的常染色体隐性遗传病，该病的发生主要由编码α珠蛋白的α基因（α1和α2）缺失引起。而目前对于该疾病的诊断主要依赖于基因分析，但常用的多重Gap-PCR检测方法通常仅限于几种常见的缺失型α-地贫基因，对于部分罕见及未知的缺失型α-地贫基因无从检测。本研究旨在建立一种能同时检测常见与罕见甚至未知缺失型α-地中海贫血的多重PCR结合荧光片段分析（Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent FragmentsAnalysis，QMPSF）方法，并探讨该方法用于检测缺失型α-地贫基因的可行性。 方法:1．根据荧光片段分析技术原理，选取50例无α基因缺失的健康对照者、50例α基因杂合缺失的α-地贫患者、50例α基因纯合缺失的α-地贫患者基因组DNA，建立应用多重定量PCR结合荧光片段分析的检测α-基因缺失的方法，α基因的拷贝数（Rα）通过样本内与样本间的两次标准化计算而获得。 2．应用建立的QMPSF方法检测579例广东和广西籍患者样本，同时利用多重Gap-PCR（检测中国人群中常见的--SEA、-α3.7与-α4.2地贫基因）进行平行检测。比较两方法结果，结果不吻合者进一步通过多重连接酶依赖的探针扩增技术（MLPA）以及后续的实验检测。 结果:1.所建立的方法能准确的检测缺失型α-地贫基因，各类样本的α基因（包括α1和α2）拷贝数（Rα）均值（SD，区间）分别为：阴性对照1.00（0.14，0.77-1.31）；α1或α2基因杂合缺失者为0.60（0.07，0.40-0.75）；α1或α2基因纯合缺失者为0.00（0.00，00.0-0.00）。 ***与多重Gap-PCR对579例样本进行平行检测结果显示：：572例样本结果吻合，7例样本结果不符合。这7例样本最终通过MLPA及后续实验证明由1例罕见缺失型--THAI/-α3.7，1例新缺失型--SEA/-α2.8，4例αααa n t i3.7，1例αααa n t i4.2组成。对于此7例样本应用建立的方法检测结果与MLPA结果一致。 结论：本文所建立的多重PCR结合荧光片段分析方法应用于α-珠蛋白基因的缺失检测，是一种准确性高、重复性好的方法，能用于常见与罕见甚至未知缺失型α-地贫基因以及α-珠蛋白基因重复突变的检测，它能提高地中海贫血携带者的检出率，可作为目前针对α-地贫的基因检测仅限于几种常见缺失型现状的很好补充。

关键词： 孕妇   地中海贫血   筛查  

摘要： 目的 探讨凭祥市孕妇产前地中海贫血筛查状况,为基层地中海贫血防治工作提供参考依据.方法 采集外周静脉血作血常规MCV、MCH检查,MCV、MCH其中一项异常者作为孕妇地中海贫血筛查表型阳性.结果 3146例孕妇中,MCV、MCH其中一项异常的有1012例,地中海贫血筛查表型阳性率为32.16%.结论 加强孕期地中海贫血筛查,避免中重度地贫儿出生,提高出生人口素质.

关键词： α地中海贫血   产前诊断   超声技术   胎儿水肿综合征   珠蛋白链   溶血性贫血   常见类型   基因缺失  

摘要： α地中海贫血（简称α地贫）是地中海贫血的常见类型,是由于α珠蛋白基因缺失或缺陷使α珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的溶血性贫血。若夫妇双方均为α地贫携带者,则有生育重型α地贫患儿的可能。重型α地贫又称血红蛋白Bart＇s胎儿水肿综合征,

关键词： 脐血   CD34+造血干细胞   地中海贫血   群体反应性抗体  

摘要： 目的探讨特异性群体反应性抗体(Panel Reactive Antibody,PRA)对脐血CD34+细胞集落形成的影响。方法取含PRA的β地贫患儿血清,与脐血CD34+细胞、补体联合孵育,行半固体集落培养,观察其对CD34+细胞集落形成影响。结果经PRA阳性血清孵育的脐血CD34+细胞经半固体集落培养所形成的集落数下降。结论地中海贫血血清PRA对脐血CD34+细胞的集落形成能力有抑制作用,补体可增强上述作用。