关键词： β-地中海贫血   补肾益髓   益髓生血颗粒   分子机制  

摘要： 分析β-地中海贫血临床研究现状以及中医中药研究进展,重点介绍中国中医科学院广安门医院近30年来基于"肾藏精生髓理论"从肾论治地中海贫血的临床探索和基础实验研究,阐述中医中药治疗β-地中海贫血的理论依据、核心病机、治则治法以及疗效特点的可能分子机制,展望中医药治疗β-地中海贫血的前景和有待深入的研究方向。

关键词： α-地中海贫血   熔解曲线分析   唾液   基因组DNA   基因诊断  

摘要： α-地中海贫血（α-thalassemia）是世界上最常见的单基因遗传性血红蛋白疾病，也是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病。该病主要是由于α-珠蛋白基因缺陷，使α-珠蛋白肽链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血。目前对该病尚无有效的治疗方法，应用DNA分析技术对该病进行早期产前诊断和选择性终止妊娠以防止重症胎儿出生，是国际上公认的首选办法。实施该方案的前提是了解待控制人群α-地中海贫血的主要突变类型及突变频率，并据此建立人群特异性的分子诊断技术。本论文凭借实时PCR技术平台，提出了一种非缺失型α-地中海贫血基因诊断的新策略。\n 第一章，首先，分别对α-地中海贫血定义、起源、分类和分子机制进行综述，并且介绍了临床最常用的生化检测方法的优缺点和目前进行α-地中海贫血基因诊断的研究进展。其次，着重阐述了实时PCR技术的原理和应用，并介绍了探针熔解曲线分析技术。最后，提出了本论文的目标、内容及意义。\n 第二章，我们首次提出了一种新的改良分子信标探针熔解曲线分析技术用于快速检测非缺失型α-地中海贫血基因突变。根据中国人群非缺失型α-地中海贫血各突变的发生频率，我们建立了两重四色突变检测体系，实现了同时对6种中国人群常见的非缺失型α-地中海贫血突变的检测和基因分型，整个过程可以在2小时内完成，灵敏度达1 ng/reaction。之后通过对临床标本的双盲实验验证了该体系用于非缺失型α-地中海贫血突变检测的准确性和可靠性，其检测结果与对照方法（反向点杂交）检测结果符合率达100％。因此，改良分子信标探针熔解曲线分析技术用于非缺失型α-地中海贫血突变检测具有快速、准确、成本低、高灵敏度、高通量等优点，适合于临床应用与推广。\n 第三章，为了探索一种无创的样本采集方式，我们提出了一种从唾液中提取人类基因组DNA的简便方法。首先，通过分光光度计OD值定量方法和实时PCR定量检测体系对唾液基因组DNA和所含的人类基因组DNA进行质量评估。其次，将唾液样本置于不同储存条件（-20℃，室温，37℃）下分别储存1周、2周、3周、4周和8周，考察基因组DNA的稳定性。最后，用非缺失型α-地中海贫血检测体系对唾液基因组DNA样本进行检测，评估所提取的唾液基因组DNA的可靠性和非缺失型α-地中海贫血检测体系用于检测唾液基因组DNA的可行性。研究结果表明，1 mL唾液的人类基因组DNA平均得率为9.2μg。不同储存条件下的唾液基因组DNA含量会随着储存时间的增加而出现一定程度的降解，但变化不显著。非缺失型α-地中海贫血检测体系用于检测唾液中的基因组DNA和抗凝血基因组DNA结果无差异。因此，该方法提取的唾液基因组DNA适用于非缺失型α-地中海贫血检测体系，具有较大的应用潜力。

关键词： beta-globin gene mutations   beta-thalassaemia   MARMS   Molecular diagnostics  

摘要： Background: beta-thalassaemia is one of the most common single-gene disorders worldwide. Each ethnic population has its own common mutations, accounting for the majority of cases, with a small number of mutations for the rarer alleles. Due to the heterogeneity of beta-thalassaemia and the multi-ethnicity of Malaysians, molecular diagnostics may be expensive and time consuming. Methods: A simple polymerase chain reaction (PCR) approach involving a multiplex amplification refractory mutation system (MARMS) and one amplification refractory mutation system (ARMS), consisting of 20 beta-globin gene mutations, were designed and employed to investigate beta-thalassaemia patients and carriers. Results: Out of 169 carriers tested with the MARMS, Cd 41/42 (-TTCT), Cd 26 (A-G) HbE, IVS 1-1 (G-T), and IVS 1-5 (G-C) were the most common mutations, accounting for 78.1%. Among the Malays, Cd 26 (A-G) HbE, Cd 41/42 (-TTCT), IVS 1-1 (G-T), and IVS 1-5 (G-C) were the most common mutations, accounting for 81.4%, whereas Cd 41/42 (-TTCT) and IVS 2-654 (C-T) were most common among the Chinese (79.1%). Conclusion: We propose the use of this cheap, easy to interpret, and simple system for the molecular diagnostics of beta-thalassaemia among Malaysians at the Institute for Medical Research (IMR).

关键词： β thalassemia   bathophenanthroline   hemochromatosis   Non transferrin bound iron   transferrin  

摘要： Non transferrin bound iron comprises the forms of plasma iron which are not bound to its traditional transporter plasma protein transferrin. Such forms of iron have been suggested to be toxic due to its redox activity through Haiber weiss and Fenton chemistry. Non transferrin bound iron has been widely studied in patients suffering from iron overload conditions like hemochromatosis and thalassemia receiving blood transfusion treatment due to obvious higher transferrin saturation. NTBI has been suggested to be studied by various researchers to determine the efficacy of chelators used to chelate iron in iron overload patients. Several researchers suggested a variety of methods based on diverse approaches like chromatography, fluorimetry, atomic absorption spectroscopy, spectrophotometry etc. to determine the level of Non transferrin bound iron. However none of them is still widely accepted or considered gold standard due to high complexity of methodology, requirement of sophisticated specialized instruments and accessories as well as debatable reliability. We have experimented different variation in bathophenanthroline based colorimetric method for non transferrin bound iron estimation to make it simple, rapid, cost effective and suitable to be opted in laboratories with limited resources without compromising the reliability of the results. From all the trials, protocol giving most consistent results was used to determine the NTBI value in β thalassemia patients as well as control group. We found that the high speed centrifugation with in between sample pre incubation had significantly decreased the background noise and generated the most consistent results. The mean Non transferrin bound iron value we got in β thalassemia patient group was significantly higher than the respective mean of control group. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

关键词： 地中海贫血   流行病学   发生率   儿童  

摘要： 目的：α-和β-地中海贫血（简称地贫）是世界上最常见的常染色体隐性遗传性疾病之一，是一组以α-或β-珠蛋白肽链合成减少或缺乏为特征的溶血性贫血，主要分布在全球疟疾高发的热带和亚热带地区，在我国，多见于长江以南的广大地区。据世界卫生组织估计，全球有近5亿的人口携带有血红蛋白变异基因，约占全球总人数的7%，其中约2.6亿人是α-地贫基因携带者，有8000万-9000万人是β-地贫基因携带者。并且每年至少有30万的重型地贫患儿出生。重型地中海贫血为致死性疾病，在高发区给社会和家庭带来了沉重的负担，同时也严重威胁了高发区的人口质量。目前针对重型地贫的治疗方法有限，早期世界发达地区的实践和经验已经证实：在地贫高发区通过早期筛查及遗传咨询预防重型地贫患儿出生是最有效的解决方案。通过人群的分子流行病学调查了解本地区地贫的流行情况，对于地贫的防治具有重大意义。本研究的主要目的旨在阐明α-地贫和β-地贫在重庆市的发生率、突变类型及其频率，为本地区开展地贫预防计划提供理论依据。 方法：按整群随机抽样方法，在重庆市随机抽取3个城区，与入托体检指定的妇幼保健院合作，进行连续随机抽样。共采集入托体检儿童外周静脉血标本1754例，抽取外周静脉血1.5-2mlEDTA抗凝进行地贫筛查调查。对所选取的儿童进行问卷调查，包括性别、年龄、民族及籍贯等。采集的样本进行血常规和血红蛋白电泳分析。β-地贫表型阳性指标为：MCV<80fl和（或）MCH<27pg，Hb A2>3.3%和（或）Hb F>2%。β-表型阳性样本首先进行中国人常见的18种β-地贫基因突变检测，表型阳性而未检测出中国人已知突变基因型的标本进一步采用DNA测序法进行β-珠蛋白基因分析。 从1754例标本中随机选取1057例进行α-地贫的分子流行病学调查。所有样本均进行分子鉴定，采用采用实时荧光定量PCR的方法检测α-珠蛋白基因拷贝数异常，同时Gap-PCR法检测α地贫五种缺失型(--SEA、-α3.7、-α4.2、--FIL、--THAI)，采用多重PCR技术α-珠蛋白基因多倍体进行验证，DNA测序法检测α地贫的突变型。 结果：本研究共选取重庆市入托体检儿童1754例，其中检出25例β-地贫杂合子，1例β-地贫双重杂合子，人群中β-地贫的基因携带率为1.43%。25例β-地贫携带者中，共检出7种突变类型，最常见的4种依次是CD41-42（-CTTT）、IVS-Ⅱ-654（C→T）、CD17（AAG>TAG）、βE（CD26,GAG>AAG），此四种突变型占全部突变基因的88.00%，是本地区的主要突变种类。此外，我们还发现5'UTR;+（43-40）(-AAAC)1种国内少见突变类型，并首次在中国人中发现异常血红蛋白病Hb Zurich。 1057例儿童外周血标本中共检出α-地贫基因携带者55例，其等位基因55个，故α-地贫的基因携带率为5.20%。55例α-地贫基因携带者中，共检出5种缺失型α-地贫，其中最常见的三种及构成比依次为：-3.7缺失型(-α3.7)54.55%、东南亚缺失型(--SEA)18.18%和-4.2缺失型(-α4.2)9.08%；检出8种非缺失型α-地贫，包括一例Hb Quong Sze和7例α珠蛋白基因新突变。另外检出α-三联体（ααα）24例，人群基因携带率为2.55%。本研究中，我们还发现2例发生在α珠蛋白基因上的异常血红蛋白病Hb J-Wenchang-Wuming和Hb Arya。经文献检索证实，Hb Arya是首次在中国人种中发现并报道的。 结论：本研究阐明了重庆市α-和β-地贫的人群携带率和详细的基因突变种类，首次报道了重庆市人群中α-三联体的携带率（2.55%）。并发现了7种α珠蛋白基因新突变和2种中国人群中首次报道的异常血红蛋白病，丰富了我国地贫基因和血红蛋白变体种类。研究资料为该地区的遗传咨询和儿童将来的婚育指导提供依据，也为将来在该地区开展地贫预防计划奠定基础。

关键词： 病理妊娠   地中海贫血   补铁疗法   临床药理  

摘要： 目的：通过检测孕晚期轻型地中海贫血(thalassemia minor,以下简称轻型地贫)孕妇血液中血红蛋白(haemoglobin，Hb)、血清铁蛋白(serum ferritin，SF)、可溶性转铁蛋白受体（soluble transferrin receptor, sTfR）、平均红细胞体积(meancorpuscular volume，MCV)、平均红细胞血红蛋白量(mean cell hemoglobin，MCH)及平均血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC），研究轻型地贫合并缺铁孕妇孕晚期的铁储备现状、合并缺铁时补铁治疗的必要性、可行性、补铁的适应证及监测，旨在为临床轻型地贫孕妇铁储备监测及缺铁治疗提供理论依据。　　 方法：按纳入标准我们选取108例孕妇为研究对象，分为三组:α-轻型地贫合并缺铁45例（A组），β-轻型地贫合并缺铁32例（B组），缺铁性贫血(iron-deficiencyanemia，IDA)31例（C组）。采用美国雅培Cell Dyn--3700血球分析仪测定红细胞参数（包括Hb、MCV、MCH及MCHC）;自动发光免疫分析法测定SF;双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（Elisa法）测定sTfR。给药方案采用多糖铁复合物（Polysaccharide-Iron Complex），口服，每次两粒（每粒150mg），每日一次，给药前及给药4周后检测上述血液学参数。　　 结果：⑴SF:A组、B组、C组分别为（7.31±5.11）μg/L、(14.32±5.94)μg/L、(7.57±4.54)μg/L，三组间有统计学意义（F=19.738，P＜0.05），多重比较B组高于C组和A组(P＜0.05)、C组高于A组(P=0.83)。⑵sTfR:A组、B组、C组分别为(3.62±1.03)nmol/L、(3.35±0.94)nmol/L、(2.83±0.73)nmol/L，三组间有统计学意义（F=6.696，P=0.002），多重比较A组高于B组和C组(P=0.209、P＜0.05)、B组高于C组(P=0.029)。⑶Hb:A组、B组、C组分别为（94.24±8.22）g/L、(87.31±7.02)g/L、(98.43±7.12)g/L，三组间有统计学意义（F=17.469，P＜0.05），多重比较C组高于A组和B组(P=0.019、P＜0.05)、A组高于B组(P＜0.05)。⑷MCV:A组、B组、C组分别为(69.84±6.33)fl、(70.31±7.23)fl、(76.40±8.43)fl，三组间有统计学意义（F=8.555，P＜0.05），多重比较C组高于B组和A组(P=0.001、P＜0.05)、B组高于A组(P=0.781)。⑸MCH:A组、B组、C组分别为(22.42±2.71)pg、(22.55±1.99)Pg、(24.69±3.12)Pg，三组间有统计学意义(F=7.739，P=0.001)，多重比较C组高于B组和A组(P=0.002、P＜0.05)、B组高于A组(P=0.836)。⑹MCHC:A组、B组、C组分别为:(315.53±15.34)g/L、(319.05±14.03)g/L、(313.75±12.06)g/L，三组间无统计学意义（F=1.168，P=0.315），多重比较B组高于A组和C组(P=0.283、P=0.139)、A组高于C组(P=0.589)。⑺SF:A、B、C三组治疗后较治疗前分别升高（7.39±5.48）μg/L、（8.93±6.91）μg/L、（10.67±7.63）μg/L，治疗前后差异均有统计学意义（t=9.040，P＜0.05）、(t=7.309, P＜0.05)、(t=7.791, P＜0.05)。⑻sTfR:A、B、C三组治疗后较治疗前分别降低(1.52±1.10)nmol/L、（0.57±0.61）nmol/L、(0.86±0.51)nmol/L，治疗前后差异均有统计学意义（t=9.230，P＜0.05）、(t=5.311,P＜0.05)、(t=9.383，P＜0.05)。⑼Hb:A、B、C三组治疗后较治疗前分别升高(10.19±7.26) g/L、（5.54±4.52）g/L、(8.00±19.02)g/L，治疗前后差异均有统计学意义（t=9.422，P＜0.05）、(t=6.932，P＜0.05)、(t=2.343, P=0.026)。⑽MCV:A、B、C三组治疗后较治疗前分别升高（2.49±8.59）fl、（0.74±6.39）fl、（1.77±5.96）fl，治疗前后差异均无统计学意义(t=1.948，P=0.058)、(t=0.653，P=0.519)、(t=1.65

关键词： 地中海贫血   造血干细胞移植   血细胞减少   HLA不相合   移植物抗宿主病  

摘要： 研究背景 重型β地中海贫血(thalassemia major)是β-珠蛋白链合成减少或消失,导致a-珠蛋白链不平衡和无效红细胞被破坏产生溶血性贫血的一种遗传性疾病。虽然规律输血加去铁治疗已显著改善了患者预期寿命。然而与铁过载相关的并发症并不能通过去铁治疗治愈,同时一生输血很难遵守,唯一根治疗法依然是通过异基因造血干细胞移植替代缺陷红细胞生成。我中心使用独仓NF-08-TM新预处理方案包括加强预防急性移植物抗宿主病,通过克服异基因移植高排斥率,明显提高了无关供者外周血干细胞移植和HLA全相合同胞供者移植效果。然而移植后随诊过程中我们观察到少数病人出现血细胞减少,目前病因并不清楚。可能的病因包括预处理时使用骨髓毒性药物、病毒感染及与移植相关的一些因素,如供者年龄、HLA配型,供受者CMV状态,干细胞来源和慢性移植物抗宿主病。因此找出病因十分重要,有人认为可能与使用环胞素A导致自身免疫抑制有关,另有人认为可能与慢性移植物抗宿主病或其它病因有关。至目前,尚未有关于重型地中海贫血造血干细胞移植后血细胞减少的报道及其病因,因此,我们对我中心行造血干细胞移植重型地中海贫血187例患儿资料进行总结、分析。 研究目的 本课题旨在探讨重型地中海贫血患儿在异基因造血干细胞移植28天后发生血细胞少的原因,通过对与血细胞减少的相关危险因素进行分析,以便找出与血细胞减少相关的危险因素,以此为临床治疗提供指导。 研究方法 我们回顾性的分析2009年1月～2012年11月于我中心行造血干细胞移植重型β-地中海贫血患儿187例,其中男117例,女70例,年龄2.0～16岁,中位年龄6岁。中位随访时间19个月(范围1-44个月)。120例接受变更供者移植(alternative donor transplant ADT)(无关供者109例,父母供者11例),67例行同胞移植。其中发生血细胞减少的共39例,我们对39例发生血细胞减少病人与148例未发生血细胞减少病人进行比较、分析。根据地贫患儿年龄、肝脏大小和铁蛋白水平,将重型地中海贫血分为Ⅰ度、Ⅱ度和Ⅲ度。与血细胞减少的相关危险因素包括：供受者年龄、性别、血清中巨细胞病毒感染情况,HLA配型、ABO血型、干细胞来源、移植类型、急性移植物抗宿主病及慢性移植物抗宿主病。 预处理方案、GVHD预防 所有患儿均采用我中心NF-08-TM新预防处理方案,新方案主要由环磷酰胺CY(-10天～-9天),氟达拉滨Flu(-8天～-4天),静脉马利兰Bu(-8天～-6天),塞替哌TT(-5天)组成,其中马利兰的药物剂量根据患儿年龄制定。马利兰的稳态血液浓度维持在300-600ng/m1为宜,当小于300ng/ml或大于600ng/ml时亦进行药量调整,即总量再增加或减少1.2mg/kg,增加或减少的剂量在-6d分次给药。所有的病人在移植前-45天时开始服用硫唑嘌呤3mg/kg/d及羟基脲30mg/kg/d。GVHD的预防采用联合多种免疫抑制剂,包括环胞素A(Cs-A)、吗替麦考酚酯(MMF)及短疗程的甲氨喋呤,具体方法是静脉应用环胞素A(Cs-A)-10天～-2天、剂量为1.5mg/kg.d,在-1d天～+25天剂量为3mg/kg.d,之后口服给药,使血药浓度维持在200±50ng/ml。MMF在+1天到+30天序贯给药,剂量为15mg/kg.d、分两次口服,条件是移植后没有Ⅱ度以的GVHD(graft-versus-host disease), MTX是在移植后+1天、+3天、+6天静脉给药,剂量分别是10mg/m2、10mg/m2、10mg/m2。在变更供者移植组,所有病人均接受外周血干细胞移植,且大部分患儿接受的是无关供者。 植入证据检测 移植后常规于28天、第2月、第3月、第6月及移植后1年行植入证据检测,如果一个患儿植入不佳,可能随时进行植入证据检测。供受者间性别不同者以FISH检查染色体变化为依据,性别相同者进行HLA定量监测DNA短程串联重复序列多态性分析。植入成功的标准有间接指标和直接指标。(1)、间接指标：移植后临床存活时间超过21天；各造血系统恢复正常,包括红系、粒系、淋巴系、巨核系等；临床上发生GVHD。中大的肝脾回缩至正常大小；乳酸脱氢酶(LDH)降至正常水平。(2)、直接指标：红细胞抗原(ABO和Rh型转换成供者血型)、细胞遗传学标记(外周血或骨髓性染色体转变成供者型)、HLA抗原(在HLA配型不全相合的病例中,HLA抗原转换为供者型)、分子遗传学证据(应用PCR扩增短串联重复序歹分析移植后病例外周血中,供者的遗传学标记及所占的比例)。 血细胞减少定义 满足以下标准之一我们就定义为移植28天后血细胞减少；1)外周血白细胞计数小于3G/L,

关键词： 儿童   地贫   流行病学   傣族   云南  

摘要： 目的了解云南省新平县傣族儿童地中海贫血的现状。方法用完整筛查法筛查:即对所有调查者用特康血细胞分析仪进行血细胞分析,pH8.6缓冲液醋酸纤维薄膜做电泳分析。结果花腰傣儿童的β-地贫检出率6.3%,α-地贫检出率8.7%。结论地贫在云南省新平县花腰傣儿童中属高发,该调查为云南省新平县傣族进行遗传咨询及进行地贫的预防提供了有价值的基础资料。

关键词： 非缺失型   -地中海贫血   PCR-反向点杂交   基因检测试剂盒  

摘要： -地中海贫血是世界上发病率最高的单基因遗传病之一，也是中国南方危害最大的遗传病之上，该病以缺失型为主，但非缺失型的也占相当比例。目前临床上没合适的非缺失型-地中海贫血基因突变（简称T）检测试剂盒。本文以PCR-反向点杂交法为基础，通过对引物探针的设计筛选和对PCR扩增系统、膜杂交系统及显色系统进行优化，研制了一个试剂盒。 本试剂盒生物素标记的引物Bio-ATF2和Bio-ATR1特异扩增2基因外显子Ⅲ，所得PCR产物长度约300bp，该片段与膜条上的探针在合适的反应条件下，能检测中国最常见的三种非缺失型-地中海贫血基因型。本试剂盒能达到以下几个性能指标：28例临床样本的检测结果跟DNA测序结果一致；检测其它基因型均为对应位点显色，没出现假阳性；对模板DNA进行浓度梯度检测，最低检出限达到2ng/μL；不同时间、不同人操作、不同批次的试剂盒能重复出一致的结果，性能稳定。 本试剂盒由PCR反应系统、膜杂交系统和显色系统组成检测系统可定性检测出中国人群中最常见的3种非缺失型-地中海贫血基因突变（分别为：Constant Spring(CS)、Quong Sze(QS)、Westmead(WS)），基因型与DNA测序结果一致。本试剂盒具有快速、操作简便，检测灵敏度和特异性高等优势，可用于非缺失型-地中海贫血基因突变临床患者的检测、婚前检查、辅助产前诊断。从而降低普通血液筛查法造成的-地中海贫血的漏查率，做好地中海贫血的确诊工作，减少由非缺失型-地中海贫血患者引起的社会负担和家庭负担。

关键词： 推广应用   检测MCV和MCH参数   地贫筛查方法  

摘要： 针对地中海贫血(简称地贫)遗传特点,推广应用以检测MCV和MCH参数作为地中海贫血筛查方法,在孕前和孕期进行广泛筛查,发现地贫基因携带双方并进一步做基因诊断,双方为同型基因者再进行产前诊断,胎儿诊断为重型者终止妊娠,减少重型地贫儿出生.