关键词： β-地中海贫血   β-珠蛋白   α-珠蛋白   K562细胞   慢病毒载体   基因治疗   β-地中海贫血   LCR   CD41-42突变基因   重组载体   β-地中海贫血   CD41-42突变基因   重组载体   K562细胞   β-地中海贫血   CD41-42突变基因   慢病毒   293T  

摘要： 研究背景 β-地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗传性溶血性贫血病，是因β-珠蛋白基因及其调控序列的点突变或缺失致使β-珠蛋白肽链合成减少或完全停止。β-地中海贫血的发病机制中有一类属于翻译缺陷型：突变或减少的编码序列引起的终止密码子，使得β-珠蛋白基因信使RNA合成中断，导致β-珠蛋白肽链无法正常合成，而发生β0地中海贫血，如移码突变CD41-42（-CTTT）突变和CD27/28(+C)。这不仅使患者血红蛋白水平降低，而且使原来在数量上与之持平的α-珠蛋白肽链相对过剩，这些相对过剩的游离α-珠蛋白肽链并不能形成稳定的四聚体，它们沉积在红细胞中导致了大量无效红细胞生成和红细胞膜破坏而导致红细胞寿命缩短，而β-珠蛋白根本无法表达而引起了严重的溶血性贫血。近年来，新型病毒载体HIV慢病毒载体已经成功的运用到了β-地中海贫血的基因治疗中，尤其是剪接缺陷型β-地中海贫血，这类地中海贫血可以通过慢病毒介导RNA干扰可以使得例如内含子1（如IVS-I-110,IVS1-6,IVS1-5）或者内含子2的异常剪接（如IVS-II-654，IVS-II-745）的前体mRNA的剪接位点的异常表达的反义序列恢复，从而恢复正确的拼接序列，最终恢复血红蛋白的合成[1-7]。 但是针对翻译缺陷型地中海贫血类型基因治疗的研究较少，这类型地中海贫血因为缺失片段大，现阶段无法通过RNA修复及干扰技术将其恢复正常碱基表达和肽链结构从而改善血红蛋白表达。所以只能通过导入正常人β蛋白基因补充或降低α-珠蛋白基因表达来调整α/β珠蛋白比例，但是α-珠蛋白基因干扰的有效率，β-珠蛋白基因及其调控片段的稳定表达的有效性，及α/β比例控制及协调的长期稳定性一直没有得到有效的印证。同时此类型的β重型地中海贫血基因敲除小鼠子代（th3/th3）常常死于妊娠后期，而使得该小鼠模型的研究一直受阻。 本课题在人红白血病细胞株K562细胞研究的基础上针对了广西最常见β-地中海贫血CD41-42突变型等翻译缺陷型地中海贫血类型，设计将2个慢病毒载体，即全长人β-珠蛋白基因慢病毒载体及α-珠蛋白基因干扰片段慢病毒载体，同时将2个慢病毒载体导入K562细胞以实现升高β-珠蛋白和降低α-珠蛋白表达来调整α/β珠蛋白比例的构想，为不同类型地中海贫血基因治疗提供更有效的证据及策略。同时对翻译突变型CD41-42型基因载体的设计及细胞模型的构建为进一步地中海贫血基因敲除小鼠模型及体内基因治疗的实施做好基础研究的准备。 研究目标 ***扩增全长人β-珠蛋白基因，将目的基因片段和慢病毒载体连接，筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin（GFP），并进行测序验证。包装病毒，测定病毒浓度。 2.验证K562细胞上α-珠蛋白基因的mRNA表达情况，模拟β0地中海贫血的细胞模型。 3.设计及合成4个针对α-珠蛋白基因的RNAi慢病毒载体（RFP）。将4个载体稳定转染K562细胞，realtimePCR检测α-珠蛋白mRNA表达及干扰效率，筛选最有效的1个干扰片段用于后续实验。 4.将构建好的全长人β-珠蛋白基因慢病毒及α-珠蛋白基因RNAi慢病毒稳定转染K562细胞。检测α-珠蛋白及β-珠蛋白基因mRNA及蛋白表达，观察基因添加及干扰效果，以验证α/β珠蛋白比例调节使得β0型地中海贫血症状得到缓解的研究目的。 方法 1.提取人β-珠蛋白表达正常者的DNA，PCR扩增全长2100bp人β-珠蛋白基因片段，加上SphI和NotI两个酶切位点进行T载体克隆，获得重组质粒pUC57-β-globin。用限制性内切酶，将目的基因片段和慢病毒载体pLVEF1a/GFP+Puro连接，筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin，并进行测序验证。验证后将慢病毒载体转染293T细胞，包装病毒，测定病毒滴度。 2.将人慢性髓原白血病细胞K562细胞培养至对数增长期，选取人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87作为对照组，进行α-珠蛋白基因（Hbα2）RNA检测，检测Hbα2含量。设计目的基因及内参基因GAPDH引物，real-timePCR检测α-珠蛋白基因mRNA（Hbα2）含量。 3.针对目的基因序列，利用RNA干扰序列设计原则，根据设计经验和设计软件评估，选择4个最佳的动力学参数RNA干扰靶点序列。分别命名为Hbα2-RNAi(1)，Hbα2-RNAi(2)，Hbα2-RNAi(3)，Hbα2-RNAi(4)。合成含干扰序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链，再通过其两端所含酶切位点AgeI和EcoRI直接连入酶切后的慢病毒载体骨架PGCSIL-017上；将连接产物转入制备

关键词： beta-thalassaemias   genomics   transcriptomics   proteomics   HbF induction   gene therapy  

摘要： The beta-thalassaemias are a group of severe and rare anaemias with monogenic inheritance, a complex systemic phenotype and several treatment-related complications, caused by more than 300 mutations of the beta-globin gene. Novel therapeutic protocols, most of which are based on still experimental treatments, show great promise but significant variability of success between patients. These strategies include chemical/molecular induction of the endogenous beta-like g-globin gene or the restoration of clinically relevant gamma-globin levels by gene therapy. A small number of modifiers with significant impact on disease penetrance, severity and efficacy of treatments are known, but most remain elusive. Improvements of existing treatment regimens and optimization and application of novel treatments will critically depend on the characterization of additional disease modifiers and the stratification of patients for customized treatment regimens. This requires extensive analyses based on "OMICS", an English-language neologism which refer to different but connected fields in molecular biology and biochemistry, such as genomics, transcriptomics, exomics, proteomics, metabolomics. The major objective of OMICS is a collective characterization of pools of biological molecules ( gene sequences, transcripts, proteins and protein domains) controlling biological structures, functions and dynamics, including several involved in pathological conditions. One of the most interesting observations of genomics in beta-thalassaemias is the association between genomic sequences and high fetal haemoglobin (HbF) levels, in consideration of the fact that high HbF levels are usually associated with milder forms of beta-thalassaemia. Related to this issue, is the possibility to predict response to different therapeutic protocols on the basis of genomic analyses. For instance, three major loci (Xmn1-HBG2 single nucleotide polymorphism, HBS1L-MYB intergenic region on chromosome 6q, and BCL11A) co

关键词： β-地中海贫血   治疗   护理  

摘要： β-地中海贫血是-类由于常染色体遗传性缺陷引起血红蛋白珠蛋白肽链合成障碍。使一种或几种珠蛋白数量不足或完全缺如导致细胞易被溶解破坏的熔血性贫血，其中广西、广东、云南、贵州及海南等地区是高发区。该病严重影响病人的生活质量，预防和治疗显得极为重要。规范性的定期输血和使用去铁胺治疗可明显延长病人的寿命。我科于2013年以来对12例重型β-地中海贫血病人采用经外周静脉输注甲磺酸去铁胺（ DFO），效果理想。现将护理报告如下。

关键词： thalassemia   sickle cell disease   hemoglobin   anemia   neurological complications  

摘要： The inherited hemoglobin disorders are a challenging topic for many reasons;they are caused by a variety of interesting molecular mechanisms, have a complicated pathophysiology, they constitute a multifaceted medical problem with pain and misery for the patients and unhappiness for their families, create several diagnostic and therapeutic questions, and they have a huge social and economic impact across the countries where they occur in high frequencies.

关键词： 新生儿筛查   遗传疾病   孕前检查   上海   SMA   基因检测   地中海贫血   血片  

摘要： 如今,我们国家一直在在实行稳定的低生育政策,力求提高人口素质。但实际上,从人口学的角度来研究,一个家庭应该有两个孩子较为合适。为何我国的人口问题会一直持续到现在,并且比较严重,可能也与出生缺陷率不断发生有关。因此,我国人口素质的方方面面还有待提高。

关键词： MCV   MCH   截断值   新生儿地中海贫血  

摘要： 【目的】 探讨新生儿脐带血MCV（红细胞平均体积）和MCH（红细胞平均血红蛋白含量）筛查新生儿地中海贫血的可行性，确定MCV和MCH最佳截断值。从而达到早发现、早诊断、早治疗新生儿地贫的目的。建立电子健康档案，指导婚配，降低地贫患儿的出生率。 【方法】 选取广东省现有出生缺陷监测县（区）作为基线调查地区（每市抽1个区县），然后在该区县抽取1-5家医院（要求年分娩量大于600例），确定抽样医院共91家，在各个抽样医院收集自2012年5月至2012年12月住院分娩的新生儿合格脐血共13396例。对所有血样采用标准全自动血细胞分析仪进行全血细胞分析。同时采用我院具有自主知识产权的液相芯片技术行基因检测。全部数据结果统一录入，采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析。 【结果】 13396例新生儿脐血经基因检测，确诊α地贫基因携带者1571例（占11.73%），β地贫基因携带者500例（占3.73%），αβ复合型地贫基因携带者76例（占0.57%）。利用脐血MCV和MCH筛查新生儿α地贫的灵敏度分别为84.8%和90.3%，特异度为68.9%和74.6%，截断值是104fl和34pg；筛查新生儿β地贫的灵敏度分别为80.4%和81.6%，特异度为31.2%和34.6%，截断值是110fl和36pg。筛查新生儿αβ复合型地贫的灵敏度分别为81.6%和90.8%，特异度为68.9%和87.8%，截断值是104fl和33pg。 【结论】 新生儿脐血MCV和MCH应用于新生儿地中海贫血的早期筛查及诊断具有重要价值；综合分析不同类型地贫基因携带新生儿的脐血红细胞指标，可获得不同的截断值结果，为临床诊断做出参考；可以对有地中海贫血风险的新生儿，进行脐血筛查，再对疑似地贫患儿进行基因检测，为有此病风险的家庭提供新生儿地贫筛查服务。

关键词： gene therapy   beta-thalassemia   hematopoietic stem cells   lentiviral vectors  

摘要： beta-thalassemias are among the most common inherited monogenic disorders worldwide due to mutations in the ss-globin gene that reduce or abolish the production of the beta-globin chain resulting in transfusion-dependent chronic anemia. Currently, the only curative treatment is allogeneic hematopoietic stem cells (HSCs) transplantation, but this option is limited by the a vailability of HLA-matched donor. Gene therapy, based on autologous transplantation of genetically corrected HSCs, holds the promise to treat patients lacking a compatible bone marrow donor. Initial attempts of gene transfer have been unsuccessful due to limitations of available vectors to stably transfer a globin gene in HSCs and reach high and regulated expression in the erythroid progeny. With the advent of lentiviral vectors (LVs), based on human immunodeficiency virus, many of the initial limitations have been overcome. Since 2000 when Sadelain and co-workers first demonstrated successful globin gene transfer in murine thalassemia models with improvement of the phenotype using a recombinant beta globin/LV, several other groups have developed different vectors encoding either beta, gamma or mutated globin genes and confirmed these results in both murine models and erythroid progeny derived from patients HSCs. In light of these encouraging results, research has recently moved into clinical trials that are ongoing or soon to begin. One participant in an ongoing gene transfer trial for beta-thalassemia has achieved clinical benefit with elimination of his transfusi on re quirement. Here , developmen t and recent progress of gene therapy for beta-thalassemia is reviewed.

关键词： β-地中海贫血   miR-144/451   红细胞生成  

摘要： 目的： 研究正常和β-地中海贫血红细胞中miR-144/451的表达情况,以及miR-144/451的表达变化对β-地中海贫血表型的影响,以探寻miRNA-144/451在β-地中海贫血红细胞生成过程中的作用。 方法： 1、为了研究β-地中海贫血红细胞生成中miR-144/451的表达情况,繁殖培育足量的β-globin敲除鼠(β-地中海贫血鼠)和β-globin/miR-144/451双敲除鼠来模拟人β-地中海贫血疾病模型,进行新鼠的基因型鉴定和筛选。 2、为了研究β-地中海贫血和正常红细胞中miR-144/451的表达差异,进行以下实验：首先,培育3-6月大小β-地贫和野生型小鼠并合笼繁殖,取14.5天的β-地贫和野生型小鼠胚胎,采用miRNA芯片技术检测β-地贫/野生型胚胎肝内差异表达的miRNAs,筛选出β-地贫差异表达的miRNAs;,然后用荧光定量PCR方法检测β-地贫和野生型小鼠外周全血中miR-144/451的表达;最后,荧光定量PCR方法检测β-地贫和野生型小鼠骨髓红细胞中miR-144/451的表达。 3、观察miR-144/451对β-地中海贫血表型的影响：构建敲除miR-144/451的β-地中海贫血小鼠模型。首先,用HEMAVET950动物血液分析仪检测β-globin+/+miR-144/451+／+(野生型)、β-globin-/+miR-144/451+/+(β-地贫)、β-globin-/+miR-144/451-/-(敲除miR-144/451的β-地贫)、β-globin+/+miR-144/451-/-(miR-144/451敲除)四组小鼠的血液指标情况;然后,观察以上四组小鼠的脾脏大小及称重脾脏重量,比较组织形态学。结果： 1、小鼠的繁殖和鉴定结果表明,从分组开始繁殖6个月,约有200只小鼠育出,经基因鉴定,β-globin+/+miR-144/451+/+小鼠占51.3%、β-globin-/+miR-144/451+/+小鼠占28.3%,β-globin-/+miR-144/451-/-小鼠占2.5%。培育出研究需要的动物数量增加近3倍。 2、miRNA芯片技术结果显示β-地中海贫血小鼠胚胎肝细胞中miR-144/451的表达量显著上调;β-地中海贫血小鼠全血中miR-144/451的表达量显著高于野生型小鼠全血中miR-144/451的表达量;β-地中海贫血小鼠骨髓红细胞中miR-144/451的表达量显著高于野生型小鼠骨髓红细胞中miR-144/451的表达量。 3、构建敲除miR-144/451的β-地中海贫血小鼠模型后,动物全血分析、脾脏组织形态学分析显示,敲除β-地中海贫血小鼠miR-144/451的表达后,其贫血表型相比未降低miR-144/451的β-地中海贫血小鼠的贫血表型发生有明显的改变。结论： β-地中海贫血小鼠造血系统中miR-144/451的表达增高,而敲除miR-144/451能够改善β-地中海贫血小鼠的贫血表型,这提示对β-地中海贫血小鼠体内miR-144/451的分析有助于理解β-地中海贫血病态造血的作用机制,为后续试验提供依据,并且提示miR-144/451可能成为人类β-地中海贫血诊断和治疗的新线索和新方法。

关键词： 缺铁性贫血   地中海贫血   血常规  

摘要： 目的探究在血常规检查中如何鉴别诊断缺铁性贫血与地中海贫血。方法选自我院2010年～2012年进行血常规检测的病理报告共150份,其中检测结果分别有正常、缺铁性贫血以及轻型地中海贫血,各50份。缺铁性贫血报告为A组、轻型地中海贫血报告为B组,正常报告为C组。对比三组血常规检查中红细胞体积分分布宽度(RDW)相关数据。结果 C组RDW指数在10.5%～14.5%之间,A组RDW指数超过14.5%,B组RDW指数均不超过14.5%,A组与B组之间筛查相符率对比具有统计学意义(P<0.05)。结论在进行血常规检查时RDW筛查方法对于缺铁性贫血和地中海贫血之间的鉴别诊断准确率相对较高且操作方便,有突出的临床诊断意义。

关键词： endocrine abnormalities   beta-thalassaemia   hypogonadism   endocrinopathies  

摘要： Endocrine abnormalities are amongst the most common complications of beta-thalassaemia major (TM). This is an overview of endocrinopathies of adult patients with beta-thalassaemia major, excluding osteoporosis and fertility issues. This review will focus on emerging evidence in the last 5 years with regards to endocrinopathies in patients with TM.