关键词： 科凯恩综合征   β-地中海贫血   产前基因诊断   基因突变   全外显子组测序   经腹绒毛膜取样  

摘要： 中国是个人口大国，人口基数大,人口增长速度快，据统计,平均每30秒就有一个缺陷儿出生。及时有效地查出这些出生缺陷的病因,从而采取有效的措施减少或避免这类患儿的出生,是我国及全世界面临的一个大难题。引起出生缺陷的病因包括遗传因素、环境因素、遗传环境因素共同作用等。其中,遗传因素所致的出生缺陷占总出生缺陷致病因素的25％。目前,减少或避免遗传性出生缺陷的最有效的措施就是进行遗传诊断、遗传咨询和产前诊断。本研究通过对科凯恩综合征家系致病基因的阐明，探讨罕见复杂遗传病的遗传诊断策略;针对β-地中海贫血基因突变高风险胎儿，采用孕妇血浆胎儿游离DNA筛查四种常见父源性β-地中海贫血基因突变，探讨β-地中海贫血无创性产前基因诊断新方法。　　第一部分、科凯恩综合征的基因诊断和及产前诊断　　目的：对一个生长发育及精神运动发育迟缓、临床表现疑似科凯恩综合征家系的三姐妹患者进行遗传学分析，阐明基因突变位点，为其提供遗传咨询及产前诊断服务。　　方法:首先应用体格检查及影像学检查对该家系患者进行初步临床诊断，然后进行生物化学和遗传学检测，包括内分泌、肝肾功能、血糖检测、串联质谱分析、染色体G显带核型分析、多重连接依赖探针扩增、微阵列比较基因组杂交检测、全基因外显子组捕获测序及Sanger测序。明确致病基因突变后，患者母亲再次妊娠，于孕11+周经腹绒毛膜活检，抽取胎儿绒毛约20mg，对胎儿进行产前基因诊断。　　结果：　　1.三姐妹染色体核型均为46，XX，内分泌、生化检测、串联质谱分析、MLPA、微阵列比较基因组杂交分析结果均未发现异常,头颅MRI提示髓鞘发育不良。　　2.全外显子组捕获测序：3个患者ERCC6基因均存在(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,complementation group6 gene) C.1595A>G及C.1607T>G两个错义突变。　　3.通过Sanger测序对家系成员(包括全基因组外显子测序的3个患者和未患病的父母)进行C.1595A及C.1607T两个突变位点的测序验证,证实3个患者均存在两个错义突变,父母均只有1个突变（其中自父亲突变位点为c.1607T>G，母亲突变位点为c.1595A>G）。　　4.产前诊断：致病基因明确后，采用绒毛活检技术抽取孕妇绒毛，进行Sanger测序，证实胎儿仅遗传了父源性的C.1607T>G突变，未遗传母源性的C.1595A>G突变。　　结论：　　1.明确了ERCC6基因的C.1595A>G及C.1607>G复合杂合突变是该生长发育及精神运动发育迟缓综合征家系患者的致病原因，这是迄今尚未见文献报道的科凯恩综合征基因突变新类型。　　2.向该家系提供了准确的遗传咨询服务，并成功实施了产前诊断。　　3.利用序列捕获技术对全基因外显子区域 DNA捕获并富集后进行高通量测序，相比第一代测序方法具有规模大、通量高、稳定性好、准确度高（灵敏度99%、特异性99%）、时效性佳等一系列优点，可以检测到外显子区域的绝大部分疾病的相关变异，全基因组外显子组测序是鉴定罕见、散发的复杂遗传性疾病致病基因有效的策略。　　4.早孕期经腹绒毛活检是一种相对安全、可靠的产前诊断技术，可实现对常见的染色体病和遗传病的早期发现、早期干预，在避免缺陷儿出生的同时也可以减少孕中晚期引产带来的生理及心理创伤、伦理压力及并发症，对于那些希望在孕早期做出准确产前诊断的孕妇，早孕期经腹绒毛活检是比较理想的选择。　　第二部分、β-地中海贫血的无创性产前基因诊断　　目的：探讨利用引物介导的限制性酶切聚合酶链反应（primer-introduced restriction analysispolymerase chain reaction，PIRA-PCR）提高孕妇血浆胎儿父源性β珠蛋白基因突变的检出率，为地中海贫血无创性产前诊断提供参考。　　方法:　　1.用Primer5.0 软件对中国常见的四种β地中海贫血基因突变（IVS-II-654(C→T),CD17(A→T),-28(A→G)，CD41-42(-CTTT）进行特异引物设计,将特异性的限制性内切酶位点引入到对应的野生型所在的序列。　　2.用打断成小片段的健康成人外周血DNA样本分别与同样打断成短片段的4种不同β珠蛋白基因突变[IVS-II-654(C→T),CD17(A→T),-28(A→G)，CD41-42(-CTTT）]的β地贫基因携带者DNA样本混合，以人工模拟母体血浆中游离胎儿父源性β珠蛋白基因突变等位基因，探讨PIRA-PCR反应和Sanger测序的最佳反应条件。　　3.收集10例孕育重型β地贫高风险胎儿孕妇外周血标本，入选条件为丈夫为上述4种β珠蛋白基因突变之一，且孕妇β珠蛋白基因突变

关键词： 地中海贫血   基因突变   基因诊断   反向点杂交  

摘要： 目的：地中海贫血是由于血红蛋白基因的突变导致珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病，包括α地中海贫血和β地中海贫血两种类型，是世界上最常见和发病率最高的遗传性溶血性贫血，也是危害最严重的血红蛋白病之一。在国外以地中海沿岸国家和东南亚各国多见，我国以广东、广西、海南、四川等省（自治区）较常见。本病具有高度的遗传异质性和极大的地域民族差异，不同地区人群的发病率和基因背景差异均很大，因此，研究这些变化特征可为本病的预防及诊断提供科学依据。本课题通过了解泸州市β地中海贫血的基因突变类型及构成比，为本地区地中海贫血的诊断和预防提供理论依据，同时探讨基因诊断在地中海贫血中的重要作用。方法：1.全部病例来源为2011年1月至2013年6月在泸州医学院附属医院儿科门诊（包括儿保门诊）及住院部就诊儿童。2.所有病例均进行血常规检查，筛查出的血红蛋白（Hb）<110g/L,红细胞平均容积（MCV）<80fl或红细胞平均血红蛋白（MCH）<27pg的小细胞低色素贫血患儿，进一步做血红蛋白电泳检测。3.血红蛋白电泳检测结果中判为β地中海贫血表型阳性者，即MCV<80%，HbA2>3.2%或HbF>3.1%，进行β地贫基因检测。4.用聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)结合反向斑点杂交技术(reverse dot blot，RDB)检测常见β-珠蛋白基因上的17个位点突变，包括CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、-28(A﹥G)、CD71-72(+A)、CD17(AAG﹥TAG)、βE (GAG→AAG)、CD31(-C)、CD43(GAG﹥TAG)、-32(C﹥A)、-29(A﹥G)、-30(T﹥C)、CD14-15(+G)、CAP+40-43(-AAAC)、起始密码子Int(ATG﹥AGG)、CD27／28(+C)、IVS-Ⅰ-1（G﹥T）、IVS-Ⅰ-5（G﹥C）。首先制备DNA标本，通过PCR扩增、杂交、洗膜等步骤，最后显色观察结果，膜条有蓝色杂交斑点为阳性结果。结果：1.在进行地贫基因检查的114例β-地贫表型阳性儿童中，检测到β地贫基因突变者72例，占总检测对象的63.16%。2.72例β-地贫中共检出7种基因突变位点，分别为CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD17（AAG﹥TAG）、-28（A﹥G）、CD71-72（+A）、βE(GAG→AAG)、-32（C﹥A）。其中以CD17（AAG﹥TAG）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD41-42（-TTCT）3种基因型最为常见，占90.22%。3.基因突变组成15种基因型，包括52例杂合子(72.22%)、13例双重杂合子(18.05%)、3例三重杂合子(4.17%)和4例纯合子(5.56%)。杂合子基因型分别为: CD17(27.78%)、IVS-Ⅱ-654(22.22%)、CD41-42(19.44%)和-28(2.78%)。双重杂合子基因型分别为：IVS-Ⅱ-654/CD17(8.33%)、CD41-42/CD17(2.78%)、-28/CD17(1.39%)、CD41-42/CD71-72(1.39%)、CD41-42/βE(1.39%)、CD41-42/IVS-Ⅱ-654(1.39%)、CD41-42/-32(1.39%)。三重杂合子基因型分别为: IVS-Ⅱ-654+CD17/-32(2.78%)、CD41-42+IVS-Ⅱ-654/-28(1.39%)。纯合子基因型为: CD41-42/CD41-42(2.78%)和IVS-Ⅱ-654/IVS-Ⅱ-654(2.78%)。结论：1.泸州地区儿童β-地贫基因突变以CD17（AAG﹥TAG）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD41-42（-TTCT）最为多见。2.基因型以杂合子频率较高。3.泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高，应加强β地贫筛查，以做到及早诊断。***-PCR技术在β地贫的检测中诊断率高，适合于中国人群常见的突变类型β-地贫基因检测。

关键词： α-地中海贫血   分子流行病学   基因诊断   新生儿脐血   红细胞参数  

摘要： 目的：研究贵阳地区α-地中海贫血的发生率以及基因型分型;了解新生儿脐血的红细胞参数的特点及不同孕周新生儿脐血 Hb成分的变化。　　方法：（1）应用琼脂糖凝胶电泳技术，得出新生儿脐血的血红蛋白电泳结果。筛选Hb Bart’s含量阳性的标本进行基因检测。(2)应用基因组DNA提取技术，对新生儿脐血的基因组 DNA进行提取并测定浓度和纯度。应用跨越断裂点聚合酶链反应（跨越断裂点 PCR）技术对已提取的新生儿脐血基因组 DNA进行体外扩增，并应用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增产物进行分析;应用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）结合反向点杂交(Reverse Dot Blot)技术（PCR结合 RDB），对已提取的新生儿脐血基因组 DNA进行体外扩增并分析结果。(3)采用血细胞五分类仪，得出新生儿脐血的6项红细胞参数，包括 RBC、HB、HCT、 RDW、MCV和MCH;应用琼脂糖凝胶电泳技术，检测新生儿脐血的血红蛋白的成分和组成;结果：（1）在1219份脐血样本中共有36份检出Hb Bart’s阳性结果，初步诊断为α-地贫，总检出率为2.95％（36/1219）。根据Hb Bart’s含量初步进行分型，静止型12例，标准型23例，中间型1例，未检出重型α-地中海贫学;（2）基因检测共检出36份α-地中海贫血阳性结果，总检出率为2.95%（36/1219），其中，静止型12例（包括-α3.7/αα和-α4.2/αα），标准型23例（--SEA/αα），中间型1例（血红蛋白H病，包括--SEA/-α3.7和--SEA/-α4.2），未检出重型α-地贫.基因组检测未检测出非缺失型α-地中海贫血;（3）1219例新生儿脐带血血常规中的6项红细胞参数中男性新生儿的RBC、HB、HCT、 RDW高于女性新生儿，MCV和MCH低于女性新生儿;足月产儿的HB、MCV、MCH、RDW均低于早产儿，顺产新生儿的RBC、HB和HCT均高于剖宫产新生儿;除新生儿的RBC低于成人，其余5项红细胞参数均高于成人，除RBC外，女性新生儿其余5项参数均高于女性成人;Hb Bart’s阳性组新生儿脐血RBC显著高于Hb Bart’s阴性组，而HB、MCV、MCH、HCT均显著低于Hb Bart’s阴性组。并且新生儿HbA的相对含量随着孕周的增加呈上升趋势，而HbF的相对含量随着孕周的增加呈下降趋势;结论：贵阳地区α-地中海贫血的发生率诶2.95%，以标准型α-地中海贫血（--SEA/αα）为主;新生儿α-地中海贫血患者从出生起就表现为小细胞低色素性贫血，表明红细胞参数对筛查的意义，对于血红蛋白电泳Hb Bart’s阳性者，可初步确诊为α-地中海贫血。

关键词： 无创产前诊断   胎儿游离DNA   β-地中海贫血   连接酶检测技术   分子开关  

摘要： 背景和目的： 常用遗传性疾病产前诊断技术手段多为有创性操作,对孕妇及胎儿均有一定伤害，以致在临床推广及应用中受到限制。而非侵入性的产前检查方法如中孕期母血清HCG、AFP定量及超声检查的检测范围各有侧重，仅能作为遗传性疾病筛查的一种手段，不能作为诊断依据。近年来，随着胎儿游离DNA的研究不断深入使无创产前诊断方法取得巨大进展，利用孕妇血浆检测胎儿性别、RhD基因已经在国外的一些产前诊断中心开展;利用全基因组高通量测序及数字PCR等方法检测单基因疾病已有报道，目前仍处于研究阶段，成本昂贵，而且操作十分复杂。 β-地中海贫血(简称β-地贫)是一种由β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白链合成减少或严重缺乏所引起的常染色体隐性遗传单基因疾病，是以β珠蛋白基因单核苷酸突变及小片段缺失为主要分子学基础。以该疾病作为研究对象，构建高特异性、高灵敏度、可用于低丰度基因单核苷酸突变及小片段缺失检测的技术，可为利用母体血浆中胎儿单基因遗传性疾病的检测寻求一种操作简单、成本低的新方法。 2004年Lo在Lancet报道应用等位特异性荧光定量PCR技术检测β地中海贫血小片段缺失突变CD41-42(del-CTTT)。但由于等位特异性PCR检测低丰度突变时敏感度不高，目前仍未应用于临床。近年有学者发现当引物3末端人为引入耐核酸酶外切的硫代磷酸修饰的碱基时，若引物3末端与模板不能完全匹配，具有3′→5′外切酶活性的高保真DNA聚合酶不能及时切除错配碱基，造成DNA聚合反应的非成熟性终止，阻止引物继续延伸，有效地减少了PCR在检测基因突变中常出现的假阳性结果。这一研究现已应用于部分单基因遗传性疾病临床样本的检测，但目前未见应用于低丰度基因突变的检测。 在前期实验中，以β-地中海贫血常见的两种单核苷酸突变位点为目标，利用常规PCR、LDR、毛细管电泳三者相结合的技术对所建立的地中海贫血胎儿母血浆DNA实验模型进行检测，发现该方法灵敏度为1:10000,因此证明该方法能够满足自孕妇血浆检测胎儿父源性单核苷酸突变的要求。但因在此实验中的PCR产物需要经过纯化，而后再将纯化产物应用于下一步LDR反应中，在纯化过程中极易污染，直接影响实验结果的准确性。 在本研究中，我们将高保真DNA聚合酶结合硫化修饰引物构成的“分子开关”与等位特异性实时定量PCR结合来检测低丰度β地中海贫血CD41-42(del-CTTT)突变，以期用于孕妇血浆中胎儿单基因疾病小片段缺失突变的检测。而对于基因单核苷酸突变的检测方法，我们将立足于前期实验基础之上进行简化实验步骤等改良，拟将PCR扩增产物直接应用于LDR反应后再进行毛细管电泳检测，不再进行纯化等繁杂的操作步骤，以期达到减少污染、节约成本的目的。 材料和方法： 1. DNA聚合酶结合普通引物与高保真聚合酶结合硫化引物分别进行常规PCR扩增β地中海贫血CD41-42(del-CTTT)突变基因片段 全血基因组提取、引物退火温度测试[模板为正常基因组DNA与CD41-42(del-CTTT)杂合突变基因组DNA]、扩增片段切胶回收后测序。 2.高保真DNA聚合酶结合硫化引物构成的“分子开关”结合等位特异性实时定量PCR检测β地中海贫血CD41-42(del-CTTT)突变基因片段 将CD41-42(del-CTTT)杂合突变基因组DNA稀释成各浓度梯度进行扩增检测，正常基因组DNA稀释成各浓度梯度作为对照。 3.利用甲基化敏感限制性酶切法结合实时定量PCR检测高甲基化RASSF1A片段以验证孕妇血浆DNA是否存在胎儿游离DNA。 采孕妇新鲜外周血5ml，制备血浆后提取孕妇血浆DNA,限制性内切酶Hinp1I和Hha I进行酶切后，实时定量PCR以RASSF1A为靶点检测胎儿游离DNA。 4.普通PCR、LDR、毛细管电泳技术相结合的改良方法检测低丰度单核苷酸突变基因 4.1提取人类基因组全血DNA后送公司测序证实突变基因类型。将20pgCD17(A→T)突变杂合子、IVS-Ⅱ-654(C→T)杂合子突变型基因组DNA分别和1ng、10ng、50ng、100ng的正常基因组DNA混合后建立β-地贫胎儿孕妇血浆模型，正常基因组DNA作为阴性对照。PCR扩增产物进行LDR反应后结合毛细管电泳检测连接产物。计算灵敏度。 4.2检测正常孕妇血浆中的微量单核苷酸突变 正常孕妇血浆DNA中加入20pg单核苷酸突变杂合子外周血DNA后进行扩增、扩增产物电泳及LDR检测反应。 结果： 1.无3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶结合普通引物进行PCR扩增、电泳检测产物后可见未明显体现等位特异性PCR扩增的温度特异性;有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶结合硫化引物进行PCR扩增、电泳检测产物后可见PCR扩增退火温度越高，特异性越好，至67.8℃时，可判读正常基因与C

关键词： 缺失型   绵阳城区   地中海贫血  

摘要： 1.2014年10期1381页《县级医院综合能力指标体系研究》一文为基金项目:四川省卫生厅科研项目"区域内松散型医院集团模式对提高县级医院服务能力的应用研究"(项目编号:110232)。2.2014年10期1272页《绵阳城区孕妇α-地中海贫血缺失型基因分析》一文基金项目更正为"绵阳市科技局项目

关键词： 产前生化筛查检验   地中海贫血   临床价值  

摘要： 目的:探讨产前生化筛查检验对地中海贫血的临床价值。方法:选取我院近两年来接收的2200名行产前筛查并进行分娩的孕妇作为本次的研究对象,并对其进行随访调查及部分进行血清学分析。结果:本组2200名孕妇中共检出地中海贫血孕妇22名,占1%;且研究结果表明地中海贫血孕妇的PAPP-A水平、AFP浓度均明显下降,而Freeβ-HCG水平则明显上升;且地中海贫血孕妇的MCV、MCH、RDW值与正常孕妇比较均有明显统计学意义(p>0.05)。结论:产前生化筛查检验在发现地中海贫血情况、加强干预、提高优生率方面有着重要的作用,应在更大范围推广应用。

关键词： 地中海贫血   胎儿   产前超声   诊断  

摘要： 目的：观察地中海贫血高危胎儿的二维超声表现,探讨超声在地中海贫血高危胎儿产前诊断中的应用价值。方法选取2009年6月至2013年6月在广西壮族自治区民族医院行胎儿产前超声检查有异常表现,且地中海贫血基因检查诊断为地中海贫血的孕20~28周单胎儿82例为地中海贫血组,选择同时期行孕期常规产前超声检查及地中海贫血基因检查正常的孕20~28周单胎儿86例为正常胎儿组。记录两组胎儿超声检查的表现,如胎儿心脏横径、胸腔横径、心胸比值、脐动脉内径、脐静脉内径及脐动静脉内径比值等指标,比较两组胎儿超声检测结果并进行统计分析。结果地中海贫血胎儿组的心脏横径、胸腔横径、心胸比值、脐静脉内径均显著大于正常胎儿组[(22.30±3.10)mmvs(16.70±3.01)mm,(43.50±5.70)mmvs(35.10±6.30)mm,(0.51±0.02)vs (0.46±0.02),(4.98±0.58) mm vs (3.82±0.64) mm,P<0.01]；脐动静脉内径比值显著小于正常胎儿组[(0.52±0.03) vs (0.66±0.06),P<0.01]。产前超声检查对地中海贫血组胎儿的正确诊断率为92.3%,对正常组胎儿组的正确诊断率为69.4%,地中海贫血组胎儿的诊断率显著高于正常组胎儿组,差异有统计学有意义(P<0.05)。结论产前超声检查可提高地中海贫血高危胎儿的筛查率,检查方法安全、有效,适合在基层医院推广。

关键词： 黎族   海南医学院   选择作用   细胞库   地中海贫血   分子流行病学   人类的起源   人类遗传资源   酶缺乏症   携带率   永生   法医学  

摘要： 黎族分布于海南省,人口约有120万。近25年来,海南医学院科研人员对黎族人群开展了以下研究:⑴地中海贫血的分子流行病学研究显示,黎族人群oc-和p-地中海贫血的疾病基因携带率分别为50%和11.2%,且基因突变类型集中。(2)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的分子缺陷的研究,发现了黎族人群该突变起源和进化及其与疟疾选择作用关系的分子依据。(3)建立黎族永生细胞库,并载入"中国不同民族永生细胞库",由"中国不同民族基因组保存中心"北方组保存,是我国人类遗传资源的重要组成部分。(4)Y染色体20个SNP和STR位点的分析,为中华民族和现代人类的起源研究提供了有价值的分子遗传学及法医学方面的证据,对人类遗传研究做出了重大贡献。

关键词： β地中海贫血   E选择素   血小板计数   组织因子  

摘要： 目的检测β地中海贫血（地贫）患者血浆可溶性E选择素（sE-sel）、血管性血友病因子（vWF）、组织因子（TF）、组织因子途径抑制物（TFPI）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物（TAT）的水平及血小板计数（PLT），探讨广西地区β地贫患者是否存在内皮细胞的活化和损伤、TF和TFPI的失衡及血栓前状态。 方法应用ELISA法检测32例β地贫患者和10例正常人血浆sE-sel、vWF、TF、TFPI、TAT水平及自动血液学分析仪检测PLT。 结果1、PLT在中间型切脾组(623.89±210.92)×109/L和重型切脾组(523.89±83.62)×109/L均高于正常参考值及正常对照组(225.97±17.77)×109/L（P<0.05），中间型非切脾组(253.08±87.84)×109/L在正常参考值范围，且与正常对照组比较差异无统计学意义； 2、血浆sE-sel在中间型切脾组(127.79±33.69)μg/L、中间型非切脾组(86.69±33.14)μg/L及重型切脾组(81.27±36.18)μg/L均明显高于正常对照组（42.59±24.07）μg/L（P<0.05）；中间型切脾组明显高于中间型非切脾组和重型切脾组（P<0.05）； 3、中间型切脾组、中间型非切脾组及重型切脾组的血浆vWF、TF、TFPI、TAT水平与正常对照组比较差异均无统计学意义，且均在正常参考值范围内； 4、sE-sel与TFPI、sE-sel与PLT、脾切与PLT呈独立正相关（P<0.05）。 结论β地贫患者存在血管内皮细胞的活化损伤，以偶尔输血的中间型切脾患者最为严重。切脾的β地贫患者血小板计数持续异常升高。内皮细胞活化损伤和血小板计数持续异常升高可能会增加β地贫患者血栓栓塞的风险。

关键词： β-地中海贫血   β-珠蛋白   α-珠蛋白   K562细胞   慢病毒载体   基因治疗   β-地中海贫血   LCR   CD41-42突变基因   重组载体   β-地中海贫血   CD41-42突变基因   重组载体   K562细胞   β-地中海贫血   CD41-42突变基因   慢病毒   293T  

摘要： 研究背景 β-地中海贫血是一种对人类健康危害严重的遗传性溶血性贫血病，是因β-珠蛋白基因及其调控序列的点突变或缺失致使β-珠蛋白肽链合成减少或完全停止。β-地中海贫血的发病机制中有一类属于翻译缺陷型：突变或减少的编码序列引起的终止密码子，使得β-珠蛋白基因信使RNA合成中断，导致β-珠蛋白肽链无法正常合成，而发生β0地中海贫血，如移码突变CD41-42（-CTTT）突变和CD27/28(+C)。这不仅使患者血红蛋白水平降低，而且使原来在数量上与之持平的α-珠蛋白肽链相对过剩，这些相对过剩的游离α-珠蛋白肽链并不能形成稳定的四聚体，它们沉积在红细胞中导致了大量无效红细胞生成和红细胞膜破坏而导致红细胞寿命缩短，而β-珠蛋白根本无法表达而引起了严重的溶血性贫血。近年来，新型病毒载体HIV慢病毒载体已经成功的运用到了β-地中海贫血的基因治疗中，尤其是剪接缺陷型β-地中海贫血，这类地中海贫血可以通过慢病毒介导RNA干扰可以使得例如内含子1（如IVS-I-110,IVS1-6,IVS1-5）或者内含子2的异常剪接（如IVS-II-654，IVS-II-745）的前体mRNA的剪接位点的异常表达的反义序列恢复，从而恢复正确的拼接序列，最终恢复血红蛋白的合成[1-7]。 但是针对翻译缺陷型地中海贫血类型基因治疗的研究较少，这类型地中海贫血因为缺失片段大，现阶段无法通过RNA修复及干扰技术将其恢复正常碱基表达和肽链结构从而改善血红蛋白表达。所以只能通过导入正常人β蛋白基因补充或降低α-珠蛋白基因表达来调整α/β珠蛋白比例，但是α-珠蛋白基因干扰的有效率，β-珠蛋白基因及其调控片段的稳定表达的有效性，及α/β比例控制及协调的长期稳定性一直没有得到有效的印证。同时此类型的β重型地中海贫血基因敲除小鼠子代（th3/th3）常常死于妊娠后期，而使得该小鼠模型的研究一直受阻。 本课题在人红白血病细胞株K562细胞研究的基础上针对了广西最常见β-地中海贫血CD41-42突变型等翻译缺陷型地中海贫血类型，设计将2个慢病毒载体，即全长人β-珠蛋白基因慢病毒载体及α-珠蛋白基因干扰片段慢病毒载体，同时将2个慢病毒载体导入K562细胞以实现升高β-珠蛋白和降低α-珠蛋白表达来调整α/β珠蛋白比例的构想，为不同类型地中海贫血基因治疗提供更有效的证据及策略。同时对翻译突变型CD41-42型基因载体的设计及细胞模型的构建为进一步地中海贫血基因敲除小鼠模型及体内基因治疗的实施做好基础研究的准备。 研究目标 ***扩增全长人β-珠蛋白基因，将目的基因片段和慢病毒载体连接，筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin（GFP），并进行测序验证。包装病毒，测定病毒浓度。 2.验证K562细胞上α-珠蛋白基因的mRNA表达情况，模拟β0地中海贫血的细胞模型。 3.设计及合成4个针对α-珠蛋白基因的RNAi慢病毒载体（RFP）。将4个载体稳定转染K562细胞，realtimePCR检测α-珠蛋白mRNA表达及干扰效率，筛选最有效的1个干扰片段用于后续实验。 4.将构建好的全长人β-珠蛋白基因慢病毒及α-珠蛋白基因RNAi慢病毒稳定转染K562细胞。检测α-珠蛋白及β-珠蛋白基因mRNA及蛋白表达，观察基因添加及干扰效果，以验证α/β珠蛋白比例调节使得β0型地中海贫血症状得到缓解的研究目的。 方法 1.提取人β-珠蛋白表达正常者的DNA，PCR扩增全长2100bp人β-珠蛋白基因片段，加上SphI和NotI两个酶切位点进行T载体克隆，获得重组质粒pUC57-β-globin。用限制性内切酶，将目的基因片段和慢病毒载体pLVEF1a/GFP+Puro连接，筛选获得慢病毒表达载体LV-β-globin，并进行测序验证。验证后将慢病毒载体转染293T细胞，包装病毒，测定病毒滴度。 2.将人慢性髓原白血病细胞K562细胞培养至对数增长期，选取人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87作为对照组，进行α-珠蛋白基因（Hbα2）RNA检测，检测Hbα2含量。设计目的基因及内参基因GAPDH引物，real-timePCR检测α-珠蛋白基因mRNA（Hbα2）含量。 3.针对目的基因序列，利用RNA干扰序列设计原则，根据设计经验和设计软件评估，选择4个最佳的动力学参数RNA干扰靶点序列。分别命名为Hbα2-RNAi(1)，Hbα2-RNAi(2)，Hbα2-RNAi(3)，Hbα2-RNAi(4)。合成含干扰序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链，再通过其两端所含酶切位点AgeI和EcoRI直接连入酶切后的慢病毒载体骨架PGCSIL-017上；将连接产物转入制备