关键词： 地中海贫血   基因型   Hb Bart's胎儿水肿综合征   胎儿发育异常  

摘要： 研究背景 地中海贫血是常见的遗传血液疾病之一,也是全球公共卫生问题之一。地中海贫血的临床表现轻重不一,其中中重度贫血对胎儿、母体危害较大。目前主要通过输血及祛铁治疗维持中重度地中海贫血患者的生命。这不仅给患者造成痛苦,还给家庭、社会造成负担。因此,预防中重型地中海贫血是防控该疾病的主要策略。随着人口迁移的影响,地中海贫血在各个地区的流行病学特征正在悄然发生变化。对此,实时更新各地区的地中海贫血基因型构成比及完善基因型谱,有助于为当地制定更具有针对性的防控措施。随着时代技术的不断发展,地中海贫血治疗方法的研究报道逐渐增多,但主要以中重型β-地中海贫血为主,而对于重型α-地中海贫血的报道较少。因此本研究也通过转录组测序分析进一步研究重型α-地中海贫血发育异常的发育机制,为未来探索其治疗方法提供数据基础。 方法 1.本研究选取了2017年1月1日至2022年9月30日期间在清远市人民医院门诊就诊或住院的7410例疑似地中海贫血携带者作为研究对象,对其进行地中海贫血基因检测、血红蛋白电泳及血细胞分析检查,并对可疑对象进行罕见地中海贫血基因检测。通过统计分析,分析清远市地区人群地中海贫血基因型类型、构成比及分布特点;阐明地中海贫血基因型及表现型的相关性;统计清远市罕见地中海贫血基因型类型。 2.本课题主要以5例巴氏水肿胎及3例正常胎儿为研究对象,采集血液样本进行转录组测序分析,分析巴氏水肿胎与正常胎儿之间的差异基因表达,最终得到差异基因;然后通过对差异基因进行生物学分析,进一步深入探讨巴氏水肿胎发育异常的发病机制;最终结合差异基因的相对表达量及差异倍数,我们选择了四个关键基因进行验证。本研究采用q RT-PCR技术从收集的5个巴氏水肿胎和6个正常胎儿的血液标本中提取RNA验证,以此验证测序数据的准确性。 结果 1.本次研究通过对清远市7410例外周血进行地贫基因检测,共检出携带地贫基因的有3593例,总检出率为48.48%,其中α地贫、β地贫及α合并β地贫的检出率分别为39.69%、12.66%及2.20%。清远市α-地贫中共检出常见基因类型有20种,主要为--SEA/αα（70.01%）、-α3.7/αα（13.33%）及-α4.2/αα（6.18%）;β-地中海贫血中共检出常见的基因类型有16种,主要为β41-42M/βN（43.07%）、β654M/βN（27.29%）和β-28M/βN（12.05%）;α合并β-地中海贫血中共检出常见的基因类型有34种,主要为--SEA/αα合并β41-42M/βN（29.45%）,--SEA/αα合并β654M/βN（12.27%）及β-28M/βN（12.05%）;罕见地贫基因检测共10例,其中α地贫3例,β-地贫6例及α合并β-地贫1例。 2.通过对巴氏水肿胎及正常胎儿的转录组测序数据进行差异性表达分析,可以得到共2243个差异表达基因,其中有1369个上调基因和874个下调基因,排名靠前的有HBQ1、HBM、SP6、LINC00570及HSP90AA2P5等。通过GO分析,研究发现差异基因主要存在于血红蛋白复合体、MHCII类蛋白复合物、细胞质膜等细胞组分;主要参与了气体输送、相关免疫应答等生物过程;主要催化了抗原结合、过氧化物酶活性等的分子功能。通过KEGG分析显示,有601个差异基因分布于332个通路中主要富集于内吞作用、造血细胞谱系、细胞黏附分子、抗原处理和呈递等相关通路。结合GSEA分析,我们发现这些差异基因主要富集于组织和器官发育、氧化磷酸化、同种异体移植排斥、造血和干扰素反应等通路。 结论 1.在清远地区,α地贫基因突变率明显高于β地贫基因的突变;清远市各地区的地贫基因型基本一致,其中α地贫基因突变主要以大片段缺失为主,而β地贫基因突变主要以点突变为主,这符合中国南方地区地贫基因突变的特点。同时,清远地贫人群的临床表现与地贫基因型明显相关,这为清远地区产前诊断及遗传咨询提供了实验依据。 2.本研究通过转录组测序分析及生物学分析,巴氏水肿胎存在多种差异基因的表达。通过查阅文献,这些关键差异基因的表达可能参与了胎儿生长发育的过程,其表达异常可能会导致智力发育迟缓、肢体发育异常、隐睾、小阴茎及心房间隔缺损等胎儿发育异常。本研究完善巴氏水肿胎血液样本的转录组谱,为进一步探讨巴氏水肿胎发育异常的发病机制提供依据。

关键词： 地中海贫血   患病儿童   乙型肝炎疫苗   接种疫苗   安全性   免疫原性  

摘要： 目的 评价地中海贫血（地贫）患儿接种乙型肝炎疫苗（HepB）的安全性和免疫原性，为地贫等特殊健康状态儿童的疫苗接种提供参考。方法 选取健康状态儿童为对照组（71人）,地贫患儿为地贫组（69人）,比较2组儿童按免疫程序接种疫苗后的不良事件发生率、乙肝表面抗体（抗-HBs）的几何平均浓度（GMC）和抗体阳转率。结果 2组受试者30 d内不良事件总发生率为1.7%（7/411）,地贫组不良事件发生率（2.5%）与对照组（0.9%）差异无统计学意义。接种后HepB 6个月内，地贫组抗-HBs的GMC（790.0±37.7 mIU/mL）和对照组（757.7±43.2 mIU/mL）差异无统计学意义（t=0.31,P=0.577）,地贫组抗-HBs阳转率（97.0%,64/66）与对照组（97.2%,69/71）差异无统计学意义（χ2=0.01,P=0.941）,不同性别和是否及时完成全程免疫儿童的抗-HBs GMC和阳转率差异均无统计学意义。结论 地贫患儿接种HepB具有良好的安全性和免疫原性。

关键词： 无创产前筛查(NIPT)   β-地中海贫血   游离胎儿DNA(cffDNA)   G-四链体   同时检测   电化学传感器  

摘要： 研究背景与目的: β-地中海贫血（β-thalassemia）是一种遗传性疾病,严重影响患者的生活质量,早期的诊断和干预至关重要。重型β-地中海贫血无法治愈,需要长期输血维持生命,引起巨大经济负担和社会负担。目前,胎儿产前诊断是重型β-地贫儿筛查的唯一有效途径。电化学传感器以快速检测、简便操作和低成本等优点在快速、高灵敏、准确检测地中海贫血方面有着巨大的应用潜力。 引起重型β-地中海贫血发生的突变基因类型有数种,多基因同时检测的电化学传感器在β-地中海贫血中的应用研究具有重要价值。多种信号的同时产生是多基因同时检测实现的关键。本研究结合纳米技术和电化学分析方法,基于G-四链体设计多种信号标签,创建新型电化学多组分传感平台,实现胎儿β-地中海贫血多基因同时检测,为β-地中海贫血与其他遗传性疾病的早期筛查提供新思路。 材料与方法: （1）MB/Fc-MOFs-G4标记的β-地中海贫血多基因同时检测电化学传感器 采用水热法制备了金属-有机框架纳米材料（HP-Ui O-66-NH2,简写为HP-MOFs）,随后分别与信号物质亚甲基蓝（MB）和二茂铁（Fc）超声混合得到复合材料MB-MOFs、Fc-MOFs。同时设计合成巯基化发夹核酸探针C1、C2、S1、S2和单核酸链G4。S1、S2和G4通过Au-S和Au-N键分别固载在金纳米颗粒修饰的复合材料MB-MOFs、Fc-MOFs上。在K+的作用下,G4链折叠包裹MB和Fc,形成MB-MOFs-G4和Fc-MOFs-G4。C1、C2通过Au-S键固载在以沉积金为基底的洁净玻碳电极表面。以β-地中海贫血突变基因CD41/42、CD17两种最常见的突变位点为模板合成靶标一（T1）和靶标二（T2）。当T1和T2存在时,通过碱基互补配对结合打开发夹探针C1、C2,触发C1、C2与MB-MOFs-G4和Fc-MOFs-G4中发夹探针S1、S2之间的催化发夹组装（CHA）循环反应,电极表面同时产生多种电信号变化实现检测,电化学信号变化分别与T1和T2含量有关。同时T1和T2可以被置换脱离C1、C2,从而再次激活并触发新的循环反应,产生持续增强的电信号,实现痕量标志物的检测。通过SEM、TEM、Zeta、EDS、XRD、XPS等手段对合成材料的形貌和元素分布进行了分析。采用CV、DPV和EIS等电化学方法对传感器的制备过程进行了表征,使用琼脂糖凝胶水平电泳和电化学测试验证了CHA过程及产物。优化检测条件,并在最优条件下评估传感器的性能。 （2）自组装“Ferris wheel”核酸结构信号标签用于β-地贫多基因同时超敏电化学检测的研究 设计合成巯基化发夹核酸探针C1、C2和单核酸链Poly A-G4、DNAzyme、H1、H2、T1及T2。Poly A-G4在K+的介导下分别与MB与Fc共价结合形成重复的G4单元结构,再通过Mg2+的引导经磷酸盐电荷中和促进的π-π堆积作用实现G-Wire核酸结构自组装,然后两种不同的G-Wire上的每个G4单元结构暴露的Poly A尾沿着发夹探针H1、H2的富胸腺嘧啶环通过腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）碱基配对结合,自组装成载有丰富电化学活性物质的G-circle-1与G-circle-2两个“Ferris wheel”核酸结构信号标签。在预处理后的玻碳电极上恒电位沉积金。通过Au-S键固载捕获发夹探针C1、C2。在靶标一（T1）、靶标二（T2）存在的情况下,触发C1、C2与G-circle-1、G-circle-2中H1、H2之间的催化发夹组装反应。G-circle-1与G-circle-2与电极上的C1、C2竞争性结合,电极表面同时产生两种电化学信号变化,并与T1和T2含量相关。为了降低检测的假阳性率,随后在反应体系中引入汞离子(Hg2+),同时激活Thymine-Hg2+-Thymine(T-Hg2+-T)结构的形成和汞离子依赖的DNAzyme工作,使得含有酶切位点的G4重复单元从G-circle上被置换并破碎,电信号大大降低。以琼脂糖凝胶水平电泳和电化学手段研究“Ferris wheel”核酸结构信号标签自组装的过程。采用CV、DPV和EIS等电化学方法对传感器的制备过程进行了特征描述。优化检测条件,并在最优条件下评估传感器的检测性能。 结果: ***/Fc-MOFs-G4标记的β-地中海贫血多基因同时检测电化学传感器。T1、T2的检测限（LOD）分别为25.00 amol/L和97.00 amol/L（S/N=3）,线性范围为5.00 fmol/L至500.00 fmol/L。该β-地中海贫血电化学基因传感器展现出出色的稳定性（RSD分别为2.59%和4.50%）、可重复性（RSD分别为1.16%和2.77%）和选择性。采用加标回收法,在人血

摘要： 摘要 目的 探讨β-地中海贫血(β-TM)病人的左心房(LA)应变参数与人口统计学、临床数据、心脏MR(CMR)表现以及心脏并发症(心力衰竭和心律失常)之间的关系。方法 连

摘要： 地中海贫血是全球热带和亚热带地区高发的单基因隐性遗传病，也是我国南方最常见且危害较大的遗传病。地贫的基因突变类型复杂且多样，基因检测产品通过检出受检者是否携带地贫基因及基因突变情况，为有效防控和治疗地贫提供检测依据。基因突变检测技术发展至今，涌现出多种检测技术，如高通量测序、ARMS、荧光PCR熔解曲线分析技术、基因芯片、核酸膜条、核酸质谱法等。其中，

关键词： 地中海贫血   突变   基因突变   β-地中海贫血基因   基因测序  

摘要： 目的:研究1例罕见α-地中海贫血合并β-地中海贫血基因突变类型、血液学特征和临床表现。方法:选取肇庆市高要区人民医院1例地中海贫血患儿的EDTA-K2抗凝血标本进行血液学特征分析、地中海贫血基因分型检测,并进行临床表现分析。怀疑患儿为异常血红蛋白病及β-地中海贫血基因分型存在疑问,应用第三代基因测序（纳米孔单分子测序）确定β-珠蛋白基因突变位置。结果:血红蛋白电泳检测显示,胎儿型血红蛋白（HbF）异常增高及出现血红蛋白变异体,地中海贫血基因分型检测为--SEA复合CD71-72 （+A）纯合子突变。β-珠蛋白基因测序显示,β基因存在一条染色体HBB:c.[219T> A;220G>T]突变,另一条染色体存在HBB:c.216217insA突变,检测到罕见的杂合突变。结论:发现罕见α合并β-珠蛋白基因突变,是SEA杂合缺失的α地中海贫血合并β基因一条染色体HBB:c.[219T> A;220G>T]（CD 72 AGT>AGA、CD 73 GAT> TAT）杂合突变复合另一条染色体HBB:c.216217insA （CD71/72+A）杂合突变的β地中海贫血,促进地中海贫血基因的研究发展。

关键词： β-地中海贫血动物模型   CRISPR/Cas9系统   重组腺相关病毒   精准基因编辑  

摘要： β-地中海贫血动物模型是阐明人类β-地中海贫血的发生原因、发病机制、潜在的诊疗方法和临床防治研究的重要研究工具之一。为此,本研究利用受精卵胞质注射结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立基于β-珠蛋白基因(hemoglobin subunit beta,HBB)敲除的β-地中海贫血兔模型,并在此基础上,探究利用重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)结合CRISPR/Cas9基因编辑技术建立β-地中海贫血兔模型的可行性。此外,本研究也探究了猪胚胎中精准基因编辑的效率优化。研究主要取得如下结果: 1.利用受精卵胞质注射结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立基于HBB基因敲除的β-地中海贫血兔模型 针对兔HBB基因第三外显子设计4条向导RNA(single guide RNA,sgRNA)靶序列,体外切割试验证明上述4条sgRNA均具有活性。利用显微注射技术将切割效率最高的一条sgRNA和Cas9蛋白共注射至新西兰大白兔受精卵,共计注射40枚,自体移植至9只受体母兔,其中3只母兔成功怀孕。经过足月妊娠,最终没有产下后代。推测注射的sgRNA/Cas9浓度过高引起HBB双等位基因突变导致胚胎致死。 2.利用rAAV结合CRISPR/Cas9基因编辑技术建立HBB基因敲除的β-地中海贫血模型兔 为改善上述可能因胚胎致死无法获得后代的情况,探索利用rAAV进行CRISPR/Cas9的递送,通过产生嵌合体胚胎来避免胚胎致死。将SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)基因片段和sgRNA片段包装至rAAV中,转染体外培养的兔胎儿成纤维细胞,T7E1酶切检测显示靶基因敲除成功,证实包装的rAAV具有活性。将rAAV注射至6只母兔输卵管,3只母兔成功妊娠,其中2只通过剖腹产获得6只后代,1只自然分娩获得4只后代。然而,T7E1酶切试验没有检测到基因编辑后代。 3.改造先导编辑系统和ssDNA供体模板提高精准基因编辑的效率 理论上用精准基因编辑代替基因敲除可以避免上述胚胎致死,但胚胎中的精准基因编辑效率普遍较低。本研究首先探索了先导编辑技术(prime editing,PE)对猪HBB基因CD41/42(-TCTT)、CD17(A>T)和-28(A>G)三个位点的编辑效率。体外转录先导编辑向导RNA(prime editing guide RNA,pegRNA)和PE效应蛋白的m RNA;作为优化,将pegRNA拆分成两段进行化学合成并添加硫代修饰,以提高其稳定性,体外切割结果证明其具有活性。将上述两种pegRNA分别和PE效应蛋白m RNA共注射至猪胚胎中,检测基因编辑效率,结果显示优化pegRNA引导的PE系统提高了以上三个位点的精准基因编辑效率。本研究接着探索同源重组介导的精准基因编辑在猪胚中的效率。通过在细胞中基因编辑,验证了ssDNA供体模板可以提高同源重组介导的精准基因编辑。随后在猪胚胎中进行基因编辑,结果显示EcoRI酶切位点序列敲入效率达到36%。上述方法为建立精准编辑的β-地中海贫血动物模型奠定了基础。