关键词： GDF-15   地中海贫血   铁过载   单核苷酸多态性   GDF-15   地中海贫血   铁过载   Hepcidin   EPO   FER   TrF   地中海贫血   铁过载   糖基化修饰   糖谱   凝集素芯片   凝集素免疫印迹  

摘要： 第一部分GDF-15基因多态性与地中海贫血铁过载发病风险相关性研究背景和目的GDF-15表达与地中海贫血铁过载发生、发展及治疗等方面有关,本部分研究GDF-15基因rsl058587,rsl059369和rs4808793单核苷酸多态性(SNP)位点在地中海贫血铁过载患者及健康人群中的基因分布及频率,探讨rsl058587,rsl059369和rs4808793位点基因多态性与地中海贫血铁过载遗传易感性的关系,从基因水平为地中海贫血铁过载的发病机制及治疗等方面研究提供实验基础。方法收集来自广西地区的地中海贫血铁过载患者122例,无铁过载患者162例,选取128例健康体检者作为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测GDF-15基因rsl058587,rsl059369和rs4808793位点在病例组与对照组的基因分布频率,用DNA测序法测定对应基因序列,以Hardy-Weinberg平衡(HWE)定律检验纳入病例的群体代表性及可比性。SNP等位基因及基因型的分布差异用χ2检验统计,SNP多态性与地中海贫血铁过载发病风险的关系用logistic回归方法分析。结果三组在性别和年龄构成上无统计学差异(P>0.05),具有可比性。经HWE定律检验,rs1059369和rs4808793两个位点P值均大于0.05,说明所选的样本具有群体代表性,而rs1058587位点P值小于0.001,未通过HWE平衡检验。rs1059369位点三组间的基因型分布差异有统计学意义(P<0.05);对照组等位基因分布频率较铁过载组差异有统计学意义(P<0.05),无铁过载组较对照组及铁过载组等位基因分布频率均无统计学差异(P>0.05);铁过载患者AA及AT基因型频率较正常组和无铁过载组显著增加,地中海贫血铁过载的发病风险增加(OR=2.297,95%CI=1.158-3.1014,P=0.002);携带A基因型的个体患铁过载的风险增加(OR=2.259,95%CI=1.177-3.031,P=0.003);对显性模型及隐性模型进一步分析,等位基因A携带频率(AA+AT)在对照组、无铁过载组及铁过载组逐渐升高,有显著性差异(P=0.005),增加铁过载的发病风险(OR=2.553,95%CI=1.177-3.031,P=0.003)。rs4808793位点对照组与无铁过载组及铁过载组的基因型分布差异有统计学意义(P<0.05);两个实验组基因型分布频率总体无统计学差异(P>0.05),对照组等位基因分布频率较无铁过载组及铁过载组总体差异有统计学意义(P<0.05),两个实验组等位基因分布频率总体无统计学差异(P>0.05);铁过载患者CC及CG基因型频率较正常组和地无铁过载组显著增加,地中海贫血铁过载的发病风险增加(OR=1.295,95%CI=0.557-1.631,P=0.005);携带CC基因型的个体患铁过载的风险增加(OR=1.275,95%CI=0.658-1.589,P=0.016);对显性模型及隐性模型进一步分析,可看到等位基因C携带频率(CC+CG)在对照组、无铁过载组及铁过载组逐渐升高,有显著性差异(P=0.013),增加铁过载的发病风险(OR=1.159,95%CI=0.797-1.359,P=0.553)。结论GDF-15基因多态位点rs1058587存在GG、CG基因型,以CG型为主,而未发现CC基因型,极有可能是广西地区人群的突变型等位基因频率极低,检测标本量较小,不足以检测到突变纯合子个体。GDF-15基因多态位点rs1059369及rs4808793的多态性与地中海贫血及铁过载存在一定相关性,但rs4808793的多态性与地中海贫血铁过载相关性无统计学意义。第二部分GDF-15 SNP基因型与血清GDF-15、EPO、Hepc及铁代谢相关性的研究背景和目的GDF-15具有调节Hepc的作用,是铁代谢和红系生成中的调节因子。地中海贫血患者,尤其是重症患者血清中的GDF-15水平明显高于正常人群,这表明GDF-15与地中海贫血铁过载的发生发展密切相关,但GDF-15在地中海贫血铁过载中的机制及它对预后的影响仍不清楚,其循环水平及其基因型与地中海贫血铁过载的关系尚不明确,其与地中海贫血铁过载病变严重程度的关系对阐明铁过载的作用机制至关重要。因此本项目研究GDF-15在地中海贫血中的水平、与铁代谢的相关性,希望能发现GDF-15与铁过载的关系,为铁过载的诊断增加检测指标。方法疾病组:选取2016年8月至2017年2月广西医科大学血液内科及地贫之家就诊的284例地中海贫血患者,其中铁过载组122例,无铁过载组162例,男123例,女161例,年龄为0-60岁之间,地中海贫血铁过载入选病例诊断均符合张之

关键词： 诱导多能干细胞   CRISPR/Cas9   基因修复   β-地中海贫血   α-地中海贫血  

摘要： 目的:修复复合重型地贫基因突变iPSCs的β41-42（-TCTT）以及Westmead（CAC→CAG）突变;鉴定复合重型地贫基因突变修复后的iPSCs的多能性和造血功能。方法:本研究选取羊水细胞来源的β41-42/β41-42&ααws/αα＿iPS作为实验对象,首先我们在β珠蛋白基因（HBB gene）第三个外显子下游600bp左右以及α珠蛋白基因（HBA2 gene）第三个外显子下游200bp左右分别设计β-sg RNA、α2-sg RNA,并插入载体PX330、p TP53-GFP-reporter,从而构建质粒HBB-sg RNA、HBA2-sg RNA、HBB-GFP-reporter-sg RNA、HBA2-GFP-reporter-sg RNA,通过钙转方式,将HBB-sg RNA/HBB-GFP-reporter-sg RNA和HBA2-sg RNA/HBA2-GFP-reporter-sg RNA分别转染293T细胞,利用荧光显微镜的观察以及流式分析,从而鉴定β/α2-sg RNA的切割活性。其次,我们从正常基因组中分别扩增β-sg RNA打靶位点的前2kb及后1.5Kb作为左右同源臂（LA、RA）,并插入Psimple-18T载体中的抗性基因puro片段两侧构建HBB-Donor,并且同时我们从正常基因组中分别扩增α2-sg RNA打靶位点的前800bp和后700bp,并分别插入载体PUC57的抗性基因neo两侧得到质粒HBA2-Donor。最后我们将线性化的HBB-Donor和HBB-sg RNA电转入细胞,sg RNA识别切割位点并发生DNA的损伤诱导同源重组,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序后得到β41-42M修复的iPS细胞株βN/βN&ααws/αα＿corrected iPS,将此细胞株扩增后,再将线性化的HBA2-Donor和HBA2-sg RNA电转入细胞,同样经过抗性筛选、PCR鉴定及测序后最终得到Westmead修复的iPS细胞株βN/βN&αα/αα＿corrected iPS。通过畸胎瘤实验、核型分析、多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的q RT-PCR鉴定以及造血分化、集落形成实验进一步鉴定修复后的iPSCs的功能。结果:通过上述方法,我们最终得到了HBB的41-42纯合突变以及HBA2的Westmead突变成功修复的细胞株,其β41-42纯合突变修复为杂合突变的效率高达90%,但是完全修复的效率仅1%,而Westmead修复的效率为14%。通过q RT-PCR的检测,修复后的βN/βN&αα/αα＿corrected iPSCs的多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的相对表达量与修复前的iPSCs无显著性差异。畸胎瘤实验的第4周畸胎瘤形成,共获得三个畸胎瘤,最大者约22×20mm,剥离后切片及HE染色,镜下观察可见明显的内、中、外胚层。核型分析结果显示46,XX,为正常核型。我们将修复后的iPSCs与OP9共培养的D0、D2、D4、D6、D8、D10、D12分别进行了基因OCT4、SOX2、NANOG、GATA4、T、PAX6与GAPDH的相对定量检测,其中多能性基因OCT4、SOX2、NANOG随着时间的推移逐渐降低,中胚层基因T的表达提前。同时我们分别收集了D8、D10、D12的细胞进行了流式分析,CD34+CD43+双阳性的细胞较修复前明显增高。我们在D10进行了集落形成试验,相对于修复前,修复后的iPSCs形成的红系明显增多,并且流式分析显示红细胞的量以及β珠蛋白的量明显增高。结论:本研究以羊水来源的复合重型地贫患者iPSCs为实验对象,利用CRISPR/Cas9系统成功地修复了β41-42突变和Westmead突变,并且修复后的细胞依然保持其多能性,造血功能明显改善。因此,iPSCs和CRISPR/Cas9为地中海贫血提供了一种有效的治疗方式。

关键词： 血液检验   地中海贫血   缺铁性贫血  

摘要： 目的探究血液检验在地中海贫血及缺铁性贫血中的诊断价值。方法将在我院于2016年1月至2016年12月接受血液检验的135例患者纳入研究,45例健康体检者为a组、45例地中海贫血患者为B组、45例缺铁性贫血患者为C组;三组患者均实行血液检验,对比三组患者血液检查指标情况。结果在RBC、MCH、MCV及RDW指标上,B组、C组与A组相比均存在明显差异,两组数据差异有统计学意义(P<0.05)。结论血液检验能准确区分地中海贫血及缺铁性贫血,帮助医务人员制定贫血治疗方案改善其临床症状,具有极高的诊断价值。因此值得在临床实践中使用。

关键词： 地中海贫血   分子病   临床重点专科   广西壮族自治区   重点实验室  

摘要： 广西地中海贫血防治重点实验室依托广西医科大学建立,2010年获广西壮族自治区科技厅批准。地中海贫血是遗传性溶血性疾病,广泛流行于地中海、东南亚地区和中国南方等地,是出生缺陷的主要病因,严重影响人口素质,给家庭和社会带来沉重的负担,成为影响社会和谐和发展的公共卫生问题。广西医科大学自上世纪50年代起即开展了地中海贫血防治研究,是国内最早开展地中海贫血防治的单位之一,

关键词： 地中海贫血   血红蛋白电泳   筛查  

摘要： 目的探讨全自动血红蛋白电泳在地中海贫血筛查中的应用效果。方法选取2016年1月—2017年6月于广州市番禺区何贤纪念医院进行血液检查的患者1 206例。所有患者行血液检查,抽取血液样本1 206份,行全自动血红蛋白电泳检测。观察所有患者地中海贫血分型,比较基因筛查与全自动血红蛋白电泳检测地中海贫血的阳性率。结果α地中海贫血患者62例;β地中海贫血患者40例。基因筛查与全自动血红蛋白电泳检测的地中海贫血阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论全自动血红蛋白电泳在地中海贫血筛查中的应用效果较好。

关键词： 缺铁性贫血   地中海贫血   血常规检查  

摘要： 目的 :探讨对缺铁性贫血（IDA）和地中海贫血（THAL）患者行血常规检查的临床效果。方法 :将2015年12月2016年12月我院收治的96例贫血患者作为研究对象,根据患者不同的贫血类型分为IDA组和THAL组,各48例。所有患者均接受血常规检查,观察并比较两种类型贫血在血常规检查中的不同之处。结果 :THAL组血常规检查结果显示,细胞平均体积（MCV）、红细胞体积分布宽度（RDW）显著低于IDA组;红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）显著高于IDA组,P<0.05为差异具有统计学意义。IDA组的红细胞平均血红蛋白量（MCH）与THAL组相比并不存在显著差异（P>0.05）。结论 :对地中海贫血和缺铁性贫血患者行血常规检查,能够清楚显示MCH、MCHC、RDW以及MCV指标的变化情况,并根据上述四项指标判断出患者的贫血类型。

关键词： 缺铁性   地中海   贫血   血常规检测  

摘要： 目的对血常规检验在地中海贫血和缺铁性贫血诊断与鉴别诊断中的应用价值进行分析及判定。方法选取本院2015年2月2016年1月收治的30例地中海贫血患者作为A组,同期选取30例缺铁性贫血患者作为B组,并同时予以血常规检测,将其检测结果进行对比。结果 A组地中海贫血患者的RBC（红细胞）为（4.22±0.74）×1012/L、HB（血红蛋白）为（91.44±13.28）g/L、RBC/HB（红细胞/血红蛋白）为0.05±0.03、MCV为（66.14±2.01）fl,RDV（细胞平均体积）为（12.14±1.24）%及MCHC（红细胞平均血红蛋白浓度）为（276.87±4.29）g/L,均较B组具有显著差异,P<0.05。结论 RBC、HB、RBC/HB、MCV、RDW、MCHC可作为鉴别缺铁性贫血、地中海贫血的指标,于临床中对贫血患者间的诊断具有显著差异。

关键词： 心肌做功指数   胎儿心功能   α地中海贫血   自动测量技术  

摘要： 目的:探讨应用心肌做功指数(MPI)自动测量技术评估α地中海贫血胎儿心功能状况的可行性,并分析胎儿MPI、大脑中动脉峰值流速(MCA-PSV)、心胸比率(CTR)三者应用于评估重型α地中海贫血风险的临床价值。方法:对所有胎儿进行常规二维及彩色多普勒超声检查,测量胎儿左心室MPI及其相关参数ICT、IRT、ET和MCA-PSV、CTR。对具有重型α地中海贫血风险的胎儿均行羊水穿刺或脐带血穿刺进行地中海贫血基因检测。结果:1、正常胎儿左心室MPI随孕周的增长轻微增大(r=0.256,P<0.05),胎儿左心室MPI不随心率的增大而增大(P>0.05);2、重型和中间型α地中海贫血胎儿左心室MPI高于轻型α地中海贫血和正常胎儿,差异有统计学意义(P<0.05);3、重型α地中海贫血胎儿MCA-PSV、CTR高于轻型α地中海贫血和正常胎儿,差异有统计学意义(P<0.01)。4、胎儿左心室MPI、MCA-PSV、CTR评估重型α地中海贫血风险ROC曲线下面积CTR最大,诊断价值最高,MCA-PSV诊断价值次之,MPI诊断价值最低。5、胎儿左心室MPI评估重型α地中海贫血风险的灵敏度和特异度分别为66.67%、90.24%;MPI联合MCA-PSV评估重型α地中海贫血风险的灵敏度和特异度分别为47.62%、97.56%;MPI联合CTR评估重型α地中海贫血风险的灵敏度和特异度分别为66.67%、99.19%;MPI、MCA-PSV、CTR三者联合评估重型α地中海贫血风险的灵敏度和特异度分别为47.62%、100%。结论:(1)MPI自动测量技术测量胎儿MPI简单、快捷,具有良好的可靠性和重复性。(2)胎儿左心室MPI与孕龄相关关系程度较弱,与心率无相关关系,具有良好的稳定性。(3)重型α地中海贫血胎儿左心室MPI高于正常胎儿,胎儿左心室MPI可以作为评估α地中海贫血胎儿心功能状况的一项重要指标。(4)胎儿左心室MPI、MCA-PSV、CTR均可以作为预测重型α地中海贫血一种安全的、非侵入性的可靠指标,CTR诊断价值最高,MCA-PSV次之,MPI最低。(5)MPI、MCA-PSV、CTR三者联合评估重型α地中海贫血风险的特异度为100%。

关键词： 地中海贫血   高通量分子诊断   临床筛查   快速检测  

摘要： 目的：　　为提高地中海贫血（下称地贫）的检出率，减少漏诊率，本课题采用现代高通量测序技术对地贫进行检测，涵盖地贫基因突变位点100余个，以期实现地贫的高通量、低成本和快速检测。　　方法：　　1.研究样本。所有样本均来自东莞市妇幼保健院，分为三类：⑴前瞻性血液样本，即在遗传咨询门诊中随机采集的血液样本;⑵既往血液样本，即从样本库中随机选择已经 PCR技术确诊的地贫样本;⑶产前诊断样本，即地贫高危夫妇绒毛或羊水样本。　　2.检测与评价方法。同时采用高通量分子诊断技术和PCR技术对上述三类样本进行检测，利用一致性Kappa检验进行统计分析，计算其总符合率以及Kappa值，从而对高通量分子诊断技术在临床检测上的准确性、有效性及可行性进行评价。　　结果：　　1.共完成前瞻性样本197例，PCR技术检出地贫基因突变22例（α-突变18例，β-突变3例，α合并β-突变1例），高通量分子诊断技术除检出以上基因位点外，另发现罕见型地贫6例，两种技术的总符合率为97.0%，Kappa=0.86(≥0.8)。　　2.既往血液样本共200例，PCR技术检出α-地贫突变118例，β-地贫突变65例，α-合并β-地贫突变17例;高通量分子诊断技术另发现突变位点1个。统计分析结果显示，两种技术总符合率为100%，Kappa=1.0(≥0.8)。　　3.产前诊断样本共200例，PCR技术检出α-突变110例，β-突变38例，α合并β-突变12例，高通量分子诊断技术与PCR技术一致，两种技术总符合率为100%，Kappa=1.0(≥0.8)。　　结论：　　高通量分子诊断技术不仅可检出常规PCR技术能检测到的所有地贫基因突变位点，而且可检测到地贫的罕见基因突变位点，且具有检测成本低、高通量、速度快和结果可靠等优点，更有利于地贫的普查，是未来发展的方向。

关键词： 地中海贫血   βE地贫   单核苷酸多态性   造血干细胞培养  

摘要： 地中海贫血(Thalassmeia,简称地贫)是一种严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病,属于常染色体隐性遗传。主要病因是珠蛋白基因缺陷,导致珠蛋白肽链合成减少或缺失,临床表现为不同程度的进行性溶血性贫血。东南亚是地贫发病率较高的地区,与非洲和地中海地区最常见的镰状血红蛋白病(hemoglobin sickle,Hb S)不同,东南亚以产生血红蛋白 E(hemoglobin E,Hb E)的β-地贫为主,简称β,主要是由于β-珠蛋白基因26位密码子GAG突变成AAG,导致谷氨酸(Glu)变成了赖氨酸(Lys),这种改变激活了临近调节β-珠蛋白基因mRNA剪切的隐蔽剪切位点,激活的隐蔽剪切位点能与正常剪切位点竞争,使正常剪切的mRNA产量减少,而异常剪切的mRNA不稳定,致使β-珠蛋白基因合成量减少,同时还产生部分变异体mRNA,后者可指导结构异常但仍有功能的Hb E合成。通常βE患者的临床症状表现较轻,但当βE复合其他类型的β-地贫时,临床症状具有很大差异性,且研究表明单纯的β-珠蛋白基因的突变不足以解释这种差异,这提示了βE与地贫患者表型或影响表型的因素之间可能存在某种联系,因此,在排除β-珠蛋白基因突变的基础上,针对βE患者进行研究,有助于进一步了解βE/β-地贫的致病机理,从而为根据胎儿基因型给出较准确的遗传咨询提供理论依据。胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,Hb F)是影响β-地贫临床症状的重要因素之一,其表达的增加可以在一定程度上代偿性地缓解β-地贫症状,临床上已将提高Hb F作为治疗β-地贫的基本策略之一。根据临床观察,成人体内Hb F含量具有高度数量遗传特性,研究发现与Hb F表达相关的数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)主要包括位于染色体11β15的HBG2基因的上游、6q23上的HBS1L基因与MYB基因间区域和2β15上的BCL11A基因。到目前为止,尽管在β-地贫和Hb S病患者中对Hb F表达变化的分子机制已有报道,但在β患者中的研究尚未开展。基于以上理论基础,本论文以云南特有的β患者为研究对象,以Hb F为E切入点,分析其相关数量性状多态性,并完成了 β患者造血干细胞的体外培养和红细胞的初步定向诱导,为后续的机制和治疗研究提供载体,具体内容如下:(1)βE-地贫患者Hb F相关数量性状位点的多态性分析。研究收集中国云南特有的βE杂合子DNA样本100例,βE纯合子DNA样本11例,正常人(对照组)DNA样本100例,首先,对三组人群血液学指标进行分析,结果发现,对照组、βE杂合子组、βE纯合子组组间各血液学指标均存在显著性差异,其中,平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)及血红蛋白(Hemoglobin,Hb)呈下降趋势,这与之前的研究报道相一致,胎儿血红蛋白(Hb F)含量呈显著上升趋势;然后,对以上三组进行Hb F数量性状相关位点HBG2/Gγ-XmnI(11β15)、HBS1L-MYB(6q23)和 BCL11A(2β15)上的 9 个单核苷酸多态性分析(HBG2/Gγ-XmnIrs7482144,rs7937649;BCL11Ars4671393,rs1 1886868,rs766432;HBS1L-MYBrs9399137,rs35959442,rs9402685,rs9376090),卡方检验结果显示,Gγ-XmnI 上的 rs7428]44,HBS1L-MYB 上的rs35959442以及BCL11A上的rs766432和rs4671393四个位点的卡方检验结果P<0.05,均存在有显著性差异(P<0.05),基因型分析结果显示,四个突变纯合子 rs74821 44AA、rs35959442GG、rs4671393GG 及 rs766432 AA 在 βE 患者中均显著高于对照组。等位基因分析结果显示,四个位点的突变型等位基因rs7482144A、rs35959442G、rs4671393G 及 rs766432 A 在 βE杂合子组中的比例均高于正常人群组。从而确定了 βE、Hb F与β-地贫患者表型之间确实存在相关性。(2)βE-地贫患者造血干细胞的体外培养。收集βE-地贫患者的外周血,通过流式细胞仪分选造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)并使用无血清培养基加入细胞因子进行体外培养,观察细胞增殖的过程,在增殖生长6天后,加入人促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)进行诱导分化,在加入EPO的第三天,细胞形态开始发生变化,开始进入分化阶段。这些结果可以后期机制和治疗研究提供载体,最终为βE/β-地贫的产前诊断、早期干预及治疗提供新思路,新策略。