关键词： 缺失型α-地中海贫血   多重巢式非对称荧光解链分析   分子信标   α-地中海贫血   血红蛋白HB H病   多位点突变   多聚腺苷酸尾  

摘要： 研究目的地中海贫血(简称“地贫”)是全球最常见单基因遗传病之一,临床主要分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。此病无有效治疗手段,通过人群分子筛查和基因诊断,确定携带致病基因的高风险夫妇,并对孕期胎进行产前诊断从而避免重症患儿的出生,是国内外公认的首选预防措施。就目前对于缺失型α-地中海贫血的检测方法而言,现有的技术方案都存在优势和一定的局限性,其中,成本过高,操作繁琐,开管操作存在污染隐患是最大的限制。本研究的目的是建立一种快速准确,简单高效,低成本检测α-珠蛋白基因大片段缺失新方案,有效解决目前检测方法存在的局限性。研究方法依据缺失型α-地中海贫血的分子机制,不同α-缺失型地中海贫血的缺失片段大小及断裂位点存在差异,因此,只要能检测出截短后序列,即可对相应类型地中海贫血进行准确分类。为此,本研究以正常个体及中国人群中常见α-缺失地贫类型:--SEA/,-α3 7/,-α4.2/和相对少见α-缺失地贫类型:--Thailand/为研究对象,根据缺失片段差异,在适当位置设计相应引物和探针,通过对该体系的引物浓度,探针浓度,PCR Buffer浓度,检测模板量,DNA聚合酶等组分及复性温度,循环数等反应条件进行一系列的优化与调整,最终确定缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测体系。为了探讨其临床应用的可行性,本研究又对该检测体系的灵敏度,特异性,准确率,重复性等进行了评估。研究结果依据实验目的和实验方案,通过具体实施,验证了缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测方案的可行性并确立了检测体系,此体系可对浓度大于或等于4ng/ul(磁珠法,柱式法,酚氯仿提取法)的不同基因型α-缺失地中海贫血样本实现准确分型,检测准确率为100%。四个通道批内重复性均小于0.50%,批间稳定性均小于0.70%,满足体外诊断试剂质量要求(变异系数不超过15%),达到临床应用的要求。2000例临床样本评估显示,缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测方法与传统方法(Gap-PCR或MLPA)比较,此方法可对不同基因型α-缺失地中海贫血样本实现快速、高效、准确分型。研究结论通过本研究,从方法学上建立了一种缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测体系,有效解决了传统方法成本过高和操作繁琐的局限,以及PCR产物开管操作易污染的不足。可实现单管反应,检测三种中国南方人群常见缺失型α-地中海贫血类型和一种相对少见缺失型α-地中海贫血类型,极大提高了工作效率,为缺失型α-地中海贫血的分子诊断和疾病防控提供新的技术选择。地中海贫血是最常见的单基因遗传病,也是广西地区发病率最高的疾病。在日常工作中我们经所建立的缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测方法发现一位患者的α-地中海贫血常见基因检测结果与血液学检测结果不相符,通过对先证者及核心家系成员HBA1和HBA2的测序验证,证实此患者在α2基因的PolyA区HBA2:c.*64(T>C),68(A>C),71(G>A),74(C>A),82(G>A),92(A>G),98(T>C)位点存在突变并同时合并-SEA/αα。这是一种罕见突变引起的hemoglobin H(HbH)病。在随后的工作中,我们另发现两例非亲缘关系的患者存在此种类型突变,可见此种突变并不是一种偶然现象,并在中国广西地区具有一定的发生率,分析其血液学表型,此种地中海贫血表现为中度贫血,在临床诊断和遗传咨询中应对其予以重视。

关键词： 地中海贫血   汉族   黎族   产前诊断   遗传咨询  

摘要： 目的:收集海南省汉族(夫妇双方为汉族)和黎族(夫妇双方至少一方为黎族)有生育重型地中海贫血高风险的孕妇进行羊水穿刺数据,分析汉族和黎族胎儿地贫基因突变的检出率及突变类型及突变基因。并与广东及广西两省(自治区)的地中海贫血产前诊断数据进行比较,探讨胎儿地中海贫血在海南省汉族和黎族中差异,以及与广东、广西两地的差异,通过此产前诊断数据以此表明地中海贫血的地域差异性和种族差异性,为临床产前诊断及遗传咨询提供指导。方法:本研究收集海南医学院第一附属医院生殖医学中心自2005年至2016年12月的汉族和黎族的地贫产前诊断数据,其他民族的产前诊断数据不在本研究之内。本次地贫基因检测范围包含3种α地贫缺失型和2种点突变类型,以及17种常见的β地贫点突变类型。按照汉族和黎族进行分类,统计各类别的产前诊断总例数,并对产前诊断结果按汉族和黎族分类统计,统计胎儿地贫突变类型(包括α地贫、β地贫以及αβ复合型地贫)及地贫突变基因(包括α珠蛋白基因及β珠蛋白基因的突变类型),按照计数资料统计学处理方法,通过SPSS统计分析软件进行卡方检验分析。此外收集两篇已发表的研究广东和广西两地的地贫产前诊断文献,对其地中海贫血突变类型及突变基因进行分类整理,与本研究进行比较,分析其与本研究的胎儿地贫检出率及突变基因的差异。结果:自2005年至2016年12月总共有536例汉族和588例黎族进行产前诊断,其中汉族样品中有406例携带地贫基因突变,黎族样品中有500例携带地贫基因突变,检出率分别为75.75%和85.03%。对于突变类型,在汉族地贫检测样品中,最常见的α地贫突变类型是--/αα(17.91%),最常见的β地贫突变类型为CD41-42/N(10.26%),最常见的复合型地贫为-α/αα,CD41-42/N(2.61%),而在黎族地贫检测样品中,最常见的α地贫突变类型--/αα(9.52%),最常见的β地贫突变类型为CD41-42/N(7.48%),最常见的复合型地贫为-α/αα,CD41-42/N(6.80%)。对于地贫突变基因,汉族最常见的α突变基因为--(58.25%),最常见的β突变基因为CD41-42(74.47%),黎族最常见的α突变基因为-α(34.26%),最常见的β突变基因为CD41-42(96.50%),而广东及广西地区最常见的α突变基因位均为--,检出率分别为70.17%和94.70%,最常见的β突变基因是CD41-42,检出率分别为46.15%和44.36%。对于重型地贫检出,汉族样品检出75例重型地贫(含40例α重型地贫及35例β重型地贫),而黎族样品检出53例重型地贫(含41例α重型地贫及12例β重型地贫)。结论:本研究首次通过产前诊断数据分析海南省汉族和黎族α地贫及β地贫的突变类型及突变基因型的差异,并与广东及广西两地的地贫产前诊断数据进行比较,分析结果表明,在民族差异上,海南省黎族地贫检出率较汉族地贫检出率更高。而在地域差异上,海南省β地贫检测率较广东和广西地区更高。本研究结果表明地中海贫血的突变具有民族差异性及地域差异性,本次研究为地贫遗传咨询、产前诊断及防治重型地贫出生缺陷提供了一定的临床指导意义。

关键词： 血细胞   血红蛋白   地中海贫血   应用价值  

摘要： 目的:研究分析血细胞与血红蛋白分析在地中海贫血中的应用价值.方法:回顾性分析2017年1月～2017年12月本院就诊的142例患者临床资料,将63例地中海贫血的基因携带患者设为实验组(α型36例,β型23例,αβ复合型4例),79例未携带患者设为对照组.分析对比不同筛选方式下的检测结果价值.结果:MCH在 α型、β型、αβ复合型三种地中海贫血类型中的灵敏度分别为93.7％、99.1％、92.1％,特异度为55.1％、阴性预测值为94.2％、阳性预测值为63.1％、诊断准确率为73.2％;MCV在以上指标中的数值依次为88.2％、98.6％、100.0％、65.4％、91.1％、68.2％、77.2％;HbA2在以上指标中的数值依次为28.5％、97.1％、100.0％、78.1％、67.4％、65.3％、66.8％;在筛查地中海贫血中MCH、MCV、HbA2的特异度和灵敏度进行两两对比,差异具有统计学意义(P<0.05);MCH+MCV+HbA2联合检测的特异度和阳性预测值好于MCH+MCV,而MCH+MCV在灵敏度、阴性预测值和诊断准确度等方面则好于MCH+MCV+HbA2,差异有统计学意义(P<0.05).结论:MCH+MCV在地中海贫血初筛作用中效果较好,而在诊断α型地中海贫血时,HbA2如果是作为单项指标则灵敏度低,容易发生漏检,可适当放宽判断标准,从而增加诊断的灵敏度和准确率.

关键词： 地中海贫血   缺铁性贫血   临床诊断   血常规检验  

摘要： 目的 分析地中海贫血和缺铁性贫血诊断与鉴别诊断中血常规检验的应用价值.方法 将2017年2月至2018年2月于本院接受治疗的地中海贫血患者、缺铁性贫血患者及同期实施健康体检的受检者作为调查对象各31例,分别纳入地中海贫血组、缺铁性贫血组及健康组,对比三组调查对象的血红蛋白、红细胞计数、平均红细胞血红蛋白含量及平均红细胞比容.结果 与健康组受检者相比,地中海贫血组、缺铁性贫血组患者的血红蛋白、红细胞计数、平均红细胞血红蛋白含量及平均红细胞比容存在显著差异,组间数值比较具备统计学意义(p<0.05).地中海贫血组与缺铁性组患者在血红蛋白、红细胞计数比较方面存在较大差异,地中海贫血组患者的数值相对较高(p<0.05).两组在平均红细胞血红蛋白含量及平均红细胞比容对比方面无显著区别,差值比较无统计学意义(p<0.05).结论 血常规检查的方式下能够有效观察患者的临床表现,可以作为诊断贫血症状的有效方式,且有助于准确鉴别地中海贫血或者缺铁性贫血,以便于患者后续的针对性治疗.

关键词： α-地中海贫血   基因突变   PCR  

摘要： 目的:通过分析本公司α-地中海贫血（α-地贫）基因检测结果,了解当地该基因分布情况,为地贫防控与遗传咨询提供实验室依据。方法:采用PCR-反向点杂交法对1551例标本中的α-地中海贫血基因缺失突变(--SEA、-α3. 7、-α4. 2)与位点突变（CS、QS、WS）进行检测。结果:1551例标本共检测出α-地中海贫血共112例,阳性率占7.2%,共检出7种基因型。结论:α-地中海贫血中主要以右缺失型(-α3. 7/α)和东南亚型缺失型(--SEA/αα)为主。

关键词： 地中海贫血   孕妇输血   安全护理措施  

摘要： 目的分析地中海贫血孕妇输血安全护理措施及效果。方法回顾性分析2015年1月2017年12月在我院输血的50例地中海贫血孕妇,按照入院顺序分为对照组和观察组,各25例。对照组行常规输血护理,观察组在对照组基础上行针对性输血安全护理。对比分析两组孕妇的护理满意度及并发症发生情况。结果通过对两组孕妇行不同的输血护理措施,对照组护理满意度明显低于观察组,差异有统计学意义（P<0.05）;且所有孕妇均未出现艾滋病毒感染、乙肝肝炎病毒感染及丙型肝炎病毒感染。结论对地中海贫血孕妇输血中行安全护理措施,可有效的保证输血顺利,并且提升孕妇的护理满意度,很大程度的改善孕妇的预后成效,具有临床推广意义。

关键词： 地中海贫血   基因型   基因突变   筛查  

摘要： 目的:地中海贫血(thalassemia)是全球分布范围最广、发病率最高、危害最严重的常染色体单基因隐形遗传性疾病之一,是因为珠蛋白基因的异常表达致使蛋白质合成紊乱造成的。地中海贫血广泛分布于世界各地,据统计全球约5%的人口携带该致病基因,其已被多个国家列为严重的公共健康问题,我国以两广地区、海南等南方地区为高发。由于珠蛋白基因突变的多样性,导致其基因型各不相同,其临床表现亦轻重不一,重型地中海贫血尚无经济有效的治疗策略,只能依靠规律输血、祛铁等以维持生命,可致残,甚至致死,给家庭和社会带来难以言喻的负担,也严重威胁人类生命健康。因此,通过遗传咨询及产前早期诊断是目前公认的能够减少地贫发病率的有效办法,本研究目的在于探讨四川泸州地区α和β地中海贫血患儿基因突变类型及频率,为泸州地区开展地中海贫血遗传咨询及预防计划提供理论参考。方法:1.病例来源:2013年1月至2015年12月由泸州市四县三区转诊或转送到西南医科大学附属医院就诊的血液学指标异常并已排除缺铁和其他贫血疾病的患儿,疑诊患儿均为泸州户籍。2.对血常规异常,即血红蛋白含量(Hb)<110g/L,平均红细胞容积(MCV)<80fl,平均红细胞血红蛋白量(MCH)<27pg的小细胞低色素贫血患儿,有必要行血红蛋白电泳检测,当HbA2<2.5%和/或出现HbH、HbBart’s或HbCS,未出现其他异常Hb带,为α-地中海贫血初筛阳性;当HbA2>3.5%和/或HbF>2%,为β-地中海贫血初筛阳性。对血液学表型阳性的患儿行α和β地中海贫血基因诊断。3.用跨越断裂位点(gap-PCR)技术检测国内常见3种缺失型α地中海贫血,包括--SEA、-α3.7、-α4.2;用PCR-RDB对国内8种常见和9种少见基因突变类型进行检测,包括CD41-42(-CTTT)、CD17(AAG>TAG)、IVS-II-654(C>T)、CD43(G-T)、-29(A-G)、-28(A-G)、CD71-72(+A)、βE、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、IVS-1-1(G-T)、IVS-1-5(G-C)、CD31(-C)、-30(T-C)、-32(C-A)、Int(ATG>AGG)、Cap(-AAAC)。结果:1.共检测出228例地中海贫血患儿,α-地中海贫血39人,阳性率10.21%,β-地中海贫血189人,阳性率49.47%;2.α-地中海贫血检出基因突变类型3种,基因型5种;静止型α地中海贫血共6例,分别为αα/-α3.7(12.82%),αα/-α4.2(2.56%),轻型α地中海贫血16例,为αα/--SEA(41.02%),中间型α地中海贫血共17例,分别为-α3.7/--SEA(33.33%),-α4.2/--SEA(10.27%),以αα/--SEA最高;3.β-地中海贫血检出8种基因突变类型和13种基因型,检出突变基因分别为:CD17、CD41-42、IVS-II-654、-28、CD14-15、CD71-72、CD43、βE,分别占44.04%、25.39%、21.76%、3.62%、2.07%、1.55%、1.03%、0.52%,前3种依次为CD17(A-T)(44.04%)、CD41-42(-TCTT)(25.39%)、IVS-II-654(C-T)(21.76%);13种基因型,其中杂合子183例,双重杂合子6例,以杂合子所占比例最高。结论:1.泸州地区β地中海贫血检出率高于α地中海贫血,最常见的β地中海贫血点突变基因分布为CD17(A-T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-II-654;缺失型α地中海贫血突变基因以--SEA最常见。***-PCR与PCR-RDB技术能够精确有效的对常见地中海贫血突变基因进行检测,具有较好的临床应用价值3.遗传咨询和产前早期的诊断对地中海贫血的预防和干预出生缺陷有着重要的意义。

关键词： β地中海贫血   目标区域捕获测序   罕见突变   胎儿血红蛋白   GATAD2A基因  

摘要： β地中海贫血是一种世界性的遗传血红蛋白病,高发于我国南方地区。广东广西地区携带率分别为2.54%和6.43%。β地贫致死致残率高,重型患者需要终身输血治疗和服用除铁剂,除骨髓移植外暂无有效的治疗方法。目标区域捕获测序是近年来新兴的一种二代测序方法。通过设计目标区域探针,扩增后进行二代测序。相比于一代测序和全基因组测序,目标区域捕获测序具有价格低廉和高通量的优势,广泛应用于遗传病致病基因筛查和产前诊断。β地中海贫血表型存在很大的异质性,临床表型修饰机制未完全阐明。本研究基于目标区域捕获测序技术对1142例中国地中海贫血人群样本中的相关基因进行测序分析。从测序结果中发现新的基因突变,并研究突变对β地中海贫血表型的修饰作用。GATAD2A为核小体重塑脱乙酰基酶复合物的重要组成部分,在β-YAC转基因小鼠的骨髓细胞中敲降GATAD2A可以诱导γ珠蛋白基因重新开放表达,但机制不明。在小鼠中敲除GATAD2A会导致胚胎致死,说明GATAD2A在发育过程中扮演重要角色。本研究中我们收集1142例中国南方人群地中海贫血病人的外周血,登记每个样本的临床表型资料,提取基因组DNA。对已知红细胞发育相关基因进行捕获测序。测序完成后进行对新发现突变结果进行生物信息学分析。统一遗传背景后比较先证者和对照组之间发病年龄,HbF值和输血需求的差异,研究突变对β地中海贫血表型的影响。对能够修饰β地中海贫贫血表型的突变进行Sanger测序验证,并通过功能实验研究修饰的分子机制。通过分析捕获测序结果我们首次在人群中发现GATAD2A无义突变（NM017660.4:c.19C>T,β.Arg7*）1 例。测序层数为 249 次,其中 118 次测到 T,131次测到C,突变杂合率为47.39%。Sanger测序验证突变存在。采集到GATAD2A无义突变先证者家系外周血,发现家系成员中同时携带GATAD2A和β地中海贫血突变可以导致HbF值上升。统一遗传背景后,先证者的发病年龄较对照组显著延迟（p=5.47 ×10-7）,HbF值显著上升（p=2.01×10-8）,输血需求显著下降（p=3.36 ×10-4）。使用特异性shRNA在HUDEP-2细胞中敲降GATAD2A可以导致γ珠蛋白表达上升约6倍。利用CRISPR/Cas9技术构建GATAD2A杂合无义突变HUDEP-2细胞株。在CRISPR/Cas9构建细胞株中我们发现GATAD2A表达下降约50%,γ珠蛋白表达上升约400倍。功能实验证明GATAD2A通过直接和MYB启动子区结合来正向调控MYB表达,从而抑制γ珠蛋白基因表达。本研究首次在人群中发现GATAD2A突变（NM017660.4:c.19C>T,***7*）。突变可以显著上调β地贫患者HbF水平,推迟患者发病年龄减和降低患者输血生存需求,减轻β地中海贫血严重性。本研究利用目标捕获测序技术,发现新的并以修饰β地中海贫血表型的突变,为β地中海贫血的治疗和预防提供了新的靶点。

关键词： 地中海贫血   缺铁性贫血   血常规检验  

摘要： 目的 对血常规检验在地中海贫血和缺铁性贫血鉴别诊断中的作用进行研究.方法 于2016年1月——2017年12月收治的贫血患者中选取60例进行研究,30例轻型地中海贫血为对照组,30例缺铁性贫血为观察组,均接受血常规检验,并比较其检测结果.结果 对比发现,2组患者血常规检验的多项指标均存在明显差异,且经统计学分析有意义(P<0.05).结论 在地中海贫血和缺铁性贫血的鉴别诊断中,血常规检验可以作为重要的参考指标,为临床治疗提供依据,应用价值较高.

关键词： 分子诊断   程序性细胞死亡   地中海贫血   肠道病毒   人乳头瘤病毒   乙型肝炎病毒   PCR   MTHFR   反应蛋白   甲基化   RNA  

摘要： ~~