关键词:
人胚胎干细胞
诱导多能干细胞
EHZ2基因
造血干细胞
地中海贫血
摘要:
造血干细胞诱导分化是干细胞领域研究的热点,探索不同来源的干细胞进行造血分化的研究及研究相关因子对造血分化的影响是目前干细胞领域实现临床转化的重要基础。已有研究发现,EZH2在胚胎早期发育及中胚层发育中起着重要作用,提示该基因可能参与造血分化的相关过程。目的:观察EZH2在不同类型地贫hiPS细胞系中的表达情况;探求EZH2在hESC/hiPSC造血分化中的作用。方法:本实验室建立了人ES细胞及人iPS细胞诱导分化的技术平台,在此基础上结合EZH2在造血分化功能方面的研究,并结合地中海贫血的细胞株进行了进一步的探索。H1为正常人ES细胞,是从囊胚内细胞团分离而来,AF888是羊水细胞来源的正常人iPS细胞,同时针对海南区域性遗传病地中海贫血,还建立了4株不同突变类型的地贫iPS细胞系,包括轻度β地贫hiPS细胞系AF038、AF806,重度β地贫hiPS细胞系AF077、AF884。为研究EHZ2在造血分化中的作用,在上述hESC/hiPSC中采用Crispr/Cas9技术建立EHZ2基因敲除细胞株,采用慢病毒感染建立EHZ2基因过表达细胞株,并通过q RT-PCR及Western Blotting的方法验证EZH2基因敲除、过表达情况。通过拟胚体途径诱导上述hESCs/hiPSCs向造血分化,分别收集d0、d4、d8、d12、d16天的拟胚体,通过q RT-PCR检测多能性基因OCT4、SOX2、NANOG及内、中、外三胚层标记基因GATA4、MSX1、PAX6的变化情况,然后通过流式细胞仪检测以上不同天数EBs中CD34+-CD43+、CD34+、CD43+的比率。结果:通过qRT-PCR在mRNA水平检测正常hESC/hiPSC及不同地贫类型的hiPSC共6株细胞的野生型细胞株中EZH2的表达情况,以正常的ES细胞为对照,结果显示在重度地贫hiPSC中EZH2表达下降;并在上述6个细胞系中建立稳定敲除和过表达EZH2基因的细胞株。通过拟胚体途径诱导上述hESC/ hiPSCs向造血分化,在d0-d8的拟胚体(EBS)采用悬浮培养,EBS在制备24h后便开始自发聚集形成球状。d8开始将EBS进行贴壁培养,将EBs接种在预先用Matrigel包被的培养皿,镜下可见EBs贴壁后呈克隆样生长,随着培养时间的延长,可见贴壁后的EBs发生分化。 正常ESC/iPSC在EBs诱导过程中多能性及三胚层标记基因的表达情况。H1与AF888相比,干性维持方面,在H1中敲除EZH2基因可增强干性的维持,而在AF888中敲除EHZ2后则抑制干性的维持;在H1中过表达EZH2基因可仍表现为促进干性维持,而在AF888中过表达EHZ2基因后对干性表现出抑制作用。三胚层分化方面,在H1中敲除EZH2基因可促进向内胚层和外胚层的分化,而抑制中胚层的分化,而在AF888中敲除EHZ2后对向内、中、外三胚层的分化均表现为促进作用;在H1中过表达EZH2基因变现为抑制向内、中、外三个胚层的分化,在AF888中过表达EHZ2基因后向内中外三给胚层的分化同样表现为抑制作用。 轻度地贫iPSC在EBs诱导过程中多能性及三胚层标记基因的表达情况。AF806与AF038相比,干性维持方面,在AF806中敲除EZH2基因可增强干性的维持,而在AF038中敲除EHZ2后在分化早期促进干性的维持随着分化时间的延长,促进作用减弱;在AF806中过表达EZH2基因可仍表现为促进干性维持,而在AF038中过表示EHZ2基因后对干性表现除抑制作用。三胚层分化方面,在AF806中敲除EZH2基因可促进向中胚层和外胚层的分化,而抑制内胚层的分化,而在AF038中敲除EHZ2后可促进向内胚层的分化,而抑制向中胚层、外胚层分化。在AF806中过表达EZH2基因可仍表现为抑制向内胚层的分化,促进向中胚层、外胚层的分化,而在AF038中过表示EHZ2基因后这促进向内胚层、外胚层分化,抑制向中胚层分化。重度地贫iPSC在EBs诱导过程中多能性及三胚层标记基因的表达情况。AF077与AF884相比,干性维持方面,在077中敲除EZH2基因后增强干性的维持,而在AF884中敲除EHZ2后也表现为增强干性的维持;在077中过表达EZH2基因在分化早期仍表现为促进干性维持,随着分化的进行,这种促进作用消失,而在AF884中过表示EHZ2基因后促进干性维持。三胚层分化方面,在AF077中敲除EZH2基因可促进向内、中、外胚层的分化,而在AF884中敲除EHZ2后也表现为促进向内、中、外三胚层的分化。在AF077中过表达EZH2基因对向内、中、外三个胚层的分化仍有促进作用,但该促进作用较AF077-EZH2-KO弱,在AF884中过表示EHZ2基因后向内中外三给胚层的分化同样表现为促进作用,但该促进作用较AF