关键词： 血液检验   诊断价值   地中海贫血   缺铁性贫血  

摘要： 目的:探究血液检验在地中海贫血和缺铁性贫血中的诊断价值。方法:随机选取2017年1月与2018年1月于我院接受治疗的70例贫血患者,并按照血液检验结果将其分为地中海贫血组与缺铁性贫血组,每组各35例。对两组患者的血液检验指标进行观察记录和比较。结果:地中海贫血组的红细胞数量、平均红细胞体积、血红细胞分布宽度要显著低于缺铁性贫血组;而血红蛋白、平均血红蛋白浓度、平均红细胞血红蛋白量要显著高于缺铁性贫血组,差异具有统计学意义,P<0.05。结论:血液检验能够有效地辅助地中海贫血、缺铁性贫血的鉴别,具有一定的诊断价值。推荐在临床上推广使用。

关键词： β地中海贫血   沙利度胺   胎儿血红蛋白   疗效   安全性   数量性状基因座  

摘要： 目的:多中心研究沙利度胺治疗β地中海贫血患者的有效性和安全性;探讨HBG2、BCL11A和HBS1L-MYB基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)对其疗效的影响。方法:在中国南方三个临床研究中心招募无法进行常规输血和螯合治疗的β地中海贫血患者。我们评估了使用沙利度胺治疗的短期(3个月)和长期随访(12个月和24个月)的疗效和安全性。对本研究中心因无法进行常规输血和螯合治疗而使用沙利度胺治疗的β地中海贫血患者的疗效反应进行回顾性研究,应用聚合酶连式反应(polymerase chain reaction,PCR)及DNA测序技术对HBG2(rs7482144)、BCL11A(rs11886868、rs4671393、rs766432、rs1427407)和HBS1L-MYB(rs9399137、rs4895440、rs4895441)8个位点多态性分型,分析其与沙利度胺临床反应的关系。结果:患者的总体有效率(overall response rate,ORR)为93.5%,短期随访的主要反应者(main responder,Ma R)和次要反应者(minor responder,Mi R)率分别为62.9%和30.6%。在非输血依赖性地中海贫血(non-transfusion-dependent thalassemia,NTDT)患者中,治疗后血红蛋白(hemoglobin,Hb)水平从基线平均6.8±1.1g/dl增加到9.7±1.9g/dl(P<0.001)。Hb升高主要归因于胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,Hb F)水平的升高。在输血依赖型地中海贫血(non-transfusion-dependent thalassemia,TDT)患者中,在平均Hb水平增加的同时,观察到43.5%(10/23)的患者脱离输血,52.2%(12/23)的患者输血减少50%以上。平均每年输血量从20.7±7.7个单位显著下降到5.8±6.8个单位(P<0.001)。在平均随访14.6±9.6个月(3-37个月)后,这两组患者的反应仍然可以维持。除了一名患者出现周围神经毒性,未观察到其他严重药物相关不良反应的发生。Logistic回归分析表明基线Hb F比率(P=0.038,OR=1.111,95%CI:1.006-1.226)是沙利度胺主要反应的独立危险因素。在Ma R组中HBG2 rs7482144(P=0.015),HBS1L-MYB rs9399137(P=0.029)、rs4895440(P=0.040)和rs4895441(P=0.040)次要等位基因频率明显高于Mi R+NR组。同样在高Hb组中,这4个SNPs的次要等位基因频率明显高于低Hb组(P值分别为0.001、0.027、0.045和0.045)。在NTDT患者中,随着rs7482144(P=0.011)、rs9399137(P=0.013)、rs4895440(P=0.011)和rs4895441(P=0.011)相关次要等位基因数量的增加,治疗后Hb增量显著升高。这些贡献等位基因对沙利度胺反应有着累积效应。与没有贡献等位基因的患者相比,携带1或3个次要等位基因的患者的沙利度胺主要反应比率逐渐增加(P=0.040-0.018,OR=8.556-11.000)。此外,当评估NTDT患者中4个贡献SNPs的次要等位基因的累积数量时,Hb增量会随着次要等位基因数量的增加而增加(P=0.001)。结论:沙利度胺对β地中海贫血患者具有显著的治疗效果,且疗效反应可以长期维持。周围神经毒性是令人担心的。虽然这些初步结果支持沙利度胺作为β地中海贫血治疗药物具有长期疗效,但在临床应用前仍有一些问题需要解决。HBG2和HBS1L-MYB的SNPs与中国南方β地中海贫血患者的沙利度胺反应密切相关,并且这些SNPs上的次要等位基因的累积数目可以作为该人群中疗效反应的更好的预测指标。

关键词： CRISPR/Cas9   SEA型α-地中海贫血   体外转录sgRNA   淋巴母样细胞系   质控品  

摘要： α-地中海贫血是一种常染色体单基因遗传病,是一种由基因突变导致珠蛋白结构异常、血红蛋白(hemoglobin,Hb)组成成分异常的慢性溶血性贫血。东南亚型(southeast Asia,SEA型)地中海贫血是α-地中海贫血中占比最多的类型,其遗传学特征为一条染色体上两个拷贝的α-珠蛋白基因均缺失。Hb Bart's胎儿水肿综合征是α-地中海贫血中严重的致死性疾病。当夫妻双方均为SEA型α-地中海贫血患者时,怀孕后的胎儿则存在25%的概率为Hb Bart's胎儿水肿综合征,不仅导致胎儿无法存活,还对孕妇的生命具有较大威胁。因此应加强对SEA型α-地中海贫血的检测以及其胎儿的产前检测。针对SEA型α-地中海贫血早期的检测方法包括全血细胞计数,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)以及血红蛋白电泳。近30年来,多种分子遗传学检测方法,如DNA印迹杂交和DNA测序可以准确地检测大多数α-珠蛋白基因的变异,从而诊断α-地中海贫血。然而,这些方法由于操作繁琐且成本昂贵,不适用于进行所有α-地中海贫血病例的诊断。快速的筛查方法如跨越断裂点的PCR技术(gap-PCR)现已广泛应用于7种常见的缺失型α-地中海贫血的检测。实验室为了保证检测结果的准确性,在日常检测前需对商品化试剂进行性能验证(verification),厂家在进行方法研发时,需采用阳性样本进行性能确认(validation)。实验室在日常检测中,要进行室内质量控制(internal quality control,IQC)、参加室间质量评价(external quality assessment,EQA)/能力验证(proficiency testing,PT),而这些过程都离不开质控品。通常的遗传病检测质控品可分为以下三类:第一,非细胞类质控品,如人工合成的质粒;第二,采用患者细胞构建的永生化细胞系;第三,通过基因编辑技术在正常细胞系的基础上导入目的突变获得的细胞系。但是前两种类型的质控品存在一定的局限性,如非细胞类质控品缺乏细胞基因组DNA(genomic DNA,gDNA)的提取过程;永生化的患者细胞类质控品,其所包含的突变类型较少。而通过基因编辑技术制备的质控品,不但能包含更多的突变类型,也能模拟真实样本。目前,已有研究将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于质控品的制备,但是这些研究采用的细胞系均为贴壁细胞系,尚无采用淋巴母样细胞系进行质控品制备的研究,而国际公认母亲/父亲/儿子正常家系(CEPH/UTAHPEDIGREE 1463亲子细胞系GM12878/GM12877/GM12884)中的细胞系多为淋巴母样细胞系。因此,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对淋巴母样细胞系进行突变细胞系的构建有利于在国际公认亲子细胞系中构建同种类型的突变,从而不仅可以制备出针对SEA型α-地中海贫血检测的质控品,而且可以通过亲子细胞系的配对和酶消化的方法产生匹配的母体和胎儿游离DNA(cell free DNA,fDNA),从而可以为今后α-地中海贫血无创产前检测质控品的制备打下基础。本研究中,我们以稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系为基础细胞系,根据SEA型α-地中海贫血基因突变中16号染色体上存在19kb的DNA片段缺失的特点,针对其在16号染色体上缺失片段的两个断裂位点设计两种不同的单链引导RNA(singleguide RNA,sgRNA),并在体外通过pX458重组质粒对sgRNA进行转录和纯化,将纯化好的sgRNA通过电转染的方式导入稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系中,以制备具有SEA型α-地中海贫血基因突变的细胞系。我们同时也进行了直接转染pX458重组质粒(可表达Cas蛋白和sgRNA)至普通的GM12878细胞系的研究,并比较了二者的编辑效率。对最终编辑成功的细胞系进行了gap-PCR验证、Sanger测序验证以及全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)验证。结果显示将体外转录纯化后的sgRNA经电转染至稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系相对于直接电转染pX458重组质粒至普通的GM12878细胞系是一种更有效的基因编辑方式。编辑后的单克隆细胞经gap-PCR验证的电泳结果显示在预期位置出现了电泳条带,即与SEA型α-地中海贫血的电泳条带位置相同。gap-PCR验证阳性的单克隆细胞PCR扩增产物经Sanger测序验证结果表明,在16号染色体上形成了 19kb左右的缺失突变,与SEA型α-地中海贫血基因突变缺失位置相同。但是在断裂位点处存在1 0bp左右的短片段插入或缺失突变(insertion and deletion,InDel),这相比于

关键词： 基因编辑   β-地中海贫血   γ-珠蛋白   造血干/祖细胞  

摘要： 基因编辑技术因其可以直接对基因组进行改造而被广泛应用于单基因遗传病治疗的研究中。β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因突变造成的,通过提高红细胞内的γ-珠蛋白的表达可以减轻β-地中海贫血患者的症状。有研究表明,利用慢病毒载体递送CRISPR/Cas9系统靶向CD34+造血干/祖细胞中γ-珠蛋白基因的启动子区,模拟遗传性胎儿血红蛋白持续存在症病人中天然存在的γ-珠蛋白基因启动子区-102到-114之间13bp的缺失,可以破坏转录抑制因子BCL11A在γ-珠蛋白基因启动子区的结合位点,进而提高细胞内γ-珠蛋白的表达水平,但是这种方法并不利于临床转化,一是因为慢病毒载体在人的造血干细胞中的转导效率低,二是因为慢病毒载体的随机整合会有潜在致瘤风险,而且Cas9蛋白的持续表达可能增加脱靶风险。为了能够创建直接用于临床的β-地中海贫血基因编辑基因治疗的技术平台,在本课题中,我们探究了Cas9蛋白在人的CD34+造血干/祖细胞中高效编辑的条件。我们发现,通过合成针对γ-珠蛋白基因启动子区-102到-114位点的sgRNAs,并对其两端进行了化学修饰,利用电穿孔将Cas9蛋白和经化学修饰的sgRNA-1以核糖核蛋白复合物的形式递送到β-地中海贫血患者来源的CD34+造血干/祖细胞中进行编辑,在无分选的情况下,CD34+细胞中的平均编辑效率可以达到80%以上。经过红系分化,编辑后的细胞内γ-珠蛋白mRNA相对于α-珠蛋白mRNA的平均表达水平可提高至126%,γ-珠蛋白链相对于α-珠蛋白链的平均含量可提高至64%,脱核率也提高至接近正常人的CD34+造血干/祖细胞红系分化后的细胞脱核率,而且不会产生脱靶效应。这些结果表明CRISPR/Cas9系统核糖核蛋白的递送方式可以高效编辑CD34+造血干/祖细胞的同时避免了慢病毒载体所带来的安全隐患。CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑的本质是产生双链断裂,为了开发一种不依赖双链断裂的β-地中海贫血的基因编辑疗法,我们尝试利用碱基编辑器hA3A-BE3来破坏BCL11A在γ-珠蛋白基因启动子区的结合以提高γ-珠蛋白的表达,通过电穿孔将密码子优化的hA3A-BE3蛋白和sgRNA-2递送到β-地中海贫血患者来源的CD34+造血干/祖细胞中,使γ-珠蛋白基因启动子区-114和-115处的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,虽然编辑效率只有大约15%,但是相对于未编辑细胞,编辑后的细胞内γ-珠蛋白mRNA相对于α-珠蛋白mRNA的平均水平至少提高了6.5倍。综上所述,本研究优化了CRISPR/Cas9靶向γ-珠蛋白基因启动子区以治疗β-地中海贫血的编辑体系,从概念上证明了碱基编辑技术可以用于诱导γ-珠蛋白的表达,为β-地中海贫血的基因治疗提供了新的参考。

关键词： 脱落滋养层细胞   单细胞分析   内质网染色   地中海贫血   单基因性疾病  

摘要： 研究背景与目的母体产道中的脱落胎儿细胞由于含有完整的细胞结构以及胎儿的整套基因组信息,而在非整倍体疾病、染色体微缺失、单基因性疾病以及新生儿溶血病等遗传性疾病的无创产前诊断中发挥着重要的作用。然而,脱落胎儿细胞的分离与鉴定仍缺乏快速、有效的检测方法;此外,目前尚缺乏对这些稀有细胞进行充分的胎源性验证;另外,目前这些稀有胎儿细胞在单基因性疾病的产前诊断应用仍需探究。因此,在本课题中,我们将建立一种快速、简便、有效的方法,用于脱落滋养层细胞的鉴定与分离;同时,我们将单细胞分离的胎儿细胞进行深入的、多位点的胎源性验证;在第三部分中,我们还将这些稀有细胞运用于地中海贫血的产前诊断中,并通过高通量测序分析,从而评估其在地中海贫血等单基因性疾病中的应用。研究方法1.通过ddPCR与qPCR评估脱落胎儿细胞的数目;通过显微镜荧光定量与流式细胞术等评估滋养层细胞与母体细胞差异,建立脱落滋养层细胞新型鉴定方法(内质网染色结合线性判别分析,ER-LDA);评估ER-LDA在细胞系模型与临床标本中的检测效果。2.通过单细胞分离,获取滋养层单细胞;通过免疫荧光分析脱落滋养层细胞的蛋白标志物表达情况;通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析,验证这些稀有细胞的胎源性。3.收集多个α地中海贫血与β地中海贫血孕妇病例样本,利用稀有滋养层细胞对相应的突变位点进行检测与分析;qPCR检测母体DNA与稀有滋养层细胞RHD分型,评估其用于新生儿溶血病产前检测的可能性;稀有滋养层细胞进行全外显子测序(whole exome sequencing,WES)分析,评估其在检测其他单基因性疾病致病位点中的可行性。实验结果1.脱落滋养层细胞个数约为72-5150个;内质网染色后滋养层细胞的荧光强度约为鳞状上皮细胞的3.13±1.13倍,为白细胞的2.64±0.73倍;通过ER-LDA分析,可在细胞模型中获取敏感性为99.0%、特异性为98.75%、准确性为98.83%的滋养层细胞的鉴别能力;另外,通过ER-LDA获取的单细胞基因组扩增覆盖度良好。2.通过ER-LDA分离临床标本中的滋养层细胞具有多个共同特征;均为HLA-G表达阳性或β-hCG阳性;FISH以及SRY-PCR检测候选男胎细胞可观察到Y染色体阳性信号;19个STR与22个SNP位点分析表明这些稀有细胞为胎儿来源性。3.稀有胎儿细胞可成功用于--SEA地中海贫血、-α4.2地中海贫血、多种β地中海贫血类型的突变检测,其检测结果与有创穿刺检测结果一致;通过稀有胎儿细胞RHD基因分型推测的RHD型别与血清型结果一致;稀有滋养层细胞WES分析可获取大量与疾病相关的变异位点,表明其可用于其他单基因性疾病突变位点的筛查与检测。结论我们成功地建立了一种新的、快速、有效的滋养层细胞鉴定方法,通过单细胞分离获取的稀有滋养层细胞具有完整的胎儿基因组,可用于多种地中海贫血亚型的产前诊断、RHD基因分型以及其他单基因性疾病的产前诊断。

关键词： 地中海贫血   缺铁性贫血   血常规检查   早期诊断  

摘要： 目的:对地中海贫血与缺铁性贫血患者早期诊断中血常规检查的效果及鉴别准确性进行探究,以期为其后续治疗提供相应的理论依据。方法:按照抽样原则对我院2018年9月至2020年1月期间收治的地中海贫血、缺铁性贫血患者开展研究,以地中海贫血患者为A组(45例),以缺铁性贫血患者为B组(46例),另外,选择同期进行健康体检的人群为C组(46例)。采集所有受检者的血标本,进行血常规检查,结合该检查的各项指标水平,判断血常规检查在地中海贫血与缺铁性贫血患者早期鉴别诊断准确性中的作用及价值。结果:A组、B组、C组受检者的Hb、RBC、RDW、MCV、MCH、MCHC水平对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在地中海贫血、缺铁性贫血早期诊断中应用血常规检查,可有效保证诊断结果的准确性,以明确地中海贫血、缺铁性贫血的鉴别,避免出现其他结果,值得优选。

关键词： 缺铁性贫血   地中海贫血   血常规检验   对比分析  

摘要： 目的:对比探究缺铁性贫血和地中海贫血患者的血常规检验。方法:随机抽取我院2019年下半年(6月-12月)血液科收治的100例贫血症状患者作为研究主体,回顾性分析其一般资料,根据患者的贫血性质进行分组,其中50例缺铁性贫血患者为甲组,另外50例地中海贫血患者为乙组,另取50名同期健康体检者作为丙组。3组患者同时进行血常规检查,并对比3组患者的检测结果。结果:甲、乙两组患者的红细胞体积分布(RDW)、血红蛋白(HB)以及红细胞(RBC)的检测结果较之丙组存在较大差异,具有统计学意义(P<0.05),同时甲组患者的血红细胞体积分布(RDW)检测结果明显高于乙组,而血红蛋白(HB)和红细胞(RBC)的检测结果明显低于乙组,组间比较差异具有统计学意义。结论:研究表明,通过对患者红细胞体积分布(RDW)、血红蛋白(HB)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)等方面的检测,能够准确判断患者是否患有贫血症状,而缺铁性贫血以及地中海贫血以红细胞体积分布(RDW)、血红蛋白(HB)、红细胞(RBC)作为主要的诊断标准。

关键词： 白消安   群体药代动力学   重型地中海贫血   造血干细胞移植  

摘要： 目的建立白消安在重型地中海贫血患儿中的群体药代动力学模型,为此类患儿白消安的个体化给药提供依据。方法收集静脉使用白消安的儿童地中海贫血患者306名共2142个血样,用LC-MS/MS测定白消安血药浓度,详细记录相关临床数据。使用Monolix软件建立白消安的群体药代动力学模型。结果静脉给药一室模型能很好地描述白消安的药代动力学特征,白消安的表观分布容积（V）、清除率（CL）的群体典型值分别为12.10 L,3.83 L·h;。体表面积和肌酐清除率对模型有显著影响。结论本研究成功建立的白消安群体药代动力学预测性能稳定良好,可为临床白消安的个体化给药提供参考。

关键词： 沙利度胺   地中海贫血   输血   胎儿血红蛋白   副作用  

摘要： 目的:评价沙利度胺治疗重型β地中海贫血(β thalassemia major,βTM)的疗效及安全性。方法:根据纳入标准,收集2017年6月到2019年12月在我院就诊的βTM患者中使用过沙利度胺治疗的病例并进行回顾性分析,沙利度胺服药时间需大于1个月。根据自身对照治疗前后各观察指标变化水平来评价沙利度胺疗效。观察指标主要有:输血需求(输血间隔天数及单次输血量)、红细胞参数、铁蛋白、胆红素和血红蛋白电泳结果。最后,记录治疗期间药物副作用。结果:共收集到使用过沙利度胺治疗的βTM患者17人,药物剂量为每晚睡前口服75mg或100mg。7人在治疗2.14±2.04个月(范围1～6个月)后脱离输血,总脱离输血率为41.18%;10人未脱离输血,但其中9人输血间隔时间均延长(90%),治疗 1～3月后延长4.83±4.53天(P=0.008),治疗4～6月后延长7.83±4.64天(P=0.043),输血间隔延长后没有引起Hb、RBC有统计学意义的降低,治疗前后单次输血量无差异(P值>0.05)。17人经沙利度胺治疗后Hb、RBC、MCV、MCH、MCHC、RDW-CV等均发生变化,但并不总有统计学意义,RBC变化比Hb变化更明显。治疗后12个月中,第9个月的Hb、RBC最高,Hb:107.67±12.86g/L,较治疗前升高20.28±7.83g/L(P=0.001);RBC:4.58±0.85×1012/L,较治疗前升高 1.35±0.60×1012/L(P=0.003)。MCV、MCH、MCHC 均较治疗前降低,而 RDW-CV升高。治疗后HbF比例升高49.25±35.02%(P=0.018)。治疗前后Hb差值与治疗前HbF比例正相关(r=0.722,P=0.005),与治疗前HbA比例负相关(r=-0.719,P=0.006),与治疗前HbA2比例(r=-0.495,P=0.086)不相关。治疗前后铁蛋白和胆红素的变化无统计学意义。治疗前后WBC、NEU、LYM、PLT、PT、APTT、Fg、DDI、ALT、AST、UA和CK-MB的变化无统计学意义,但血肌酐在治疗后降低了3.67±6.18μmol/L(P=0.037),具有统计学意义。药物副作用方面有4例患者用药后出现了不良反应,分别是血栓事件、转氨酶升高、皮疹和急性胃肠炎。其中发生血栓患者停药并抗凝治疗,另外3人给予相应治疗后继续服药可耐受。结论:沙利度胺(75mg/100mg qn)对βTM患者具有疗效,41.18%的患者可以脱离输血,90%的未脱离输血患者可以延长输血间隔时间。治疗后Hb、RBC、HbF升高。治疗前后Hb差值与治疗前HbF正相关,与治疗前HbA负相关。治疗后MCV、MCH、MCHC均降低,而RDW-CV升高。治疗后铁蛋白和胆红素无显着改善。药物副作用需注意血栓事件。