关键词： 血液检验   贫血   缺铁性贫血   地中海贫血   诊断  

摘要： 目的:研究血液检验在贫血鉴别诊断中的临床效果.方法:随机选取我院从2018年1月至2019年6月期间收治血液检验者作为研究对象,共150例,分为对照组和实验组.其中对照组患者为健康者,无任何血液疾病,共50例;实验组为贫血患者,共100例,其中包括50例地中海贫血患者和50例缺铁性贫血患者,最后对比两组患者血液的各项指标,包括MCV、RBC/MCV、Hb、RBC、MCH、RDW等.结果:对照组健康者的血液指标Hb、MCH、MCV明显高于实验组的患者,而实验组中的地中海贫血患者的血液指标RBC、RBC/MCV、Hb、明显高于缺铁性贫血患者,且实验组中缺铁性贫血患者的RDW指标高于对照组和实验组中的地中海贫血,以上组间比较,P<0.05,差异具有统计学意义.结论:血液检验不仅可以准确检查出患者血液各项指标,还能检测出贫血患者,对贫血患者的治疗提供了参考价值,更能有效辨别贫血种类,具有非常重要的临床意义.

关键词： 磁共振成像   铁过载   骨髓脂肪含量   地中海贫血  

摘要： 目的:1、通过建立腰椎骨髓铁过载家兔模型,探讨利用Qdixon和Histo技术定量不同程度铁过载的状态下的骨髓脂肪含量(fat fraction,FF)的准确性。2、比较Qdixon和Histo两种序列定量骨髓脂肪含量有无差异性及相关性。材料和方法:将16只家兔随机分成实验组8只和对照组8只。8只实验组每周于家兔后腿肌肉注射一次右旋糖酐铁(剂量30mg/kg),对照组不注射铁剂。注射铁剂一周后随机选取1只实验组和1只对照组进行腰椎MRI扫描,扫描内容包括常规自旋回波脉冲序列、Qdixon、Histo序列扫描。两组家兔检查前沿耳缘静脉抽取1m L静脉血查血清铁(Serum iron,SI)。MRI检查结束后处死,解剖取出第5、6腰椎行病理检查,剩余腰椎送广西分析测试研究中心测量骨髓铁含量及骨髓脂肪含量。对照组8只家兔与实验组相同时间点进行MR扫描及处死解剖。实验共持续8周。采用SPSS20.0软件分析,正态性判定使用W检验(国家标准GB4880-85)计量资料。两独立样本符合正态分布,方差齐的采用两独立样本T检验(t-sample t-test),用Qdixon、Histo序列测量的第5、6腰椎骨髓脂肪分数分别比较实验组和对照组之间的差异。采用Pearson或Spearman相关分析:1.血清铁、骨髓铁含量、肝脏铁浓度与注射铁总量之间的关系;***序列测的第5、6腰椎骨髓脂肪分数与Histo测的相应腰椎骨髓脂肪分数之间的关系;3.经原子分光光度仪测量骨髓脂肪含量、骨髓脂肪百分比与Qdixon、Histo测定的脂肪分数之间的相关关系。检验标准均为P=0.05,P<0.05差异有统计学意义。结果:注射铁总量与骨髓铁含量呈高度正相关(r=0.976,p<0.001),注射铁总量与肝脏铁浓度呈高度正相关(r=0.901,p=0.002),骨髓铁浓度与肝脏铁浓度呈高度正相关(r=0.934,p=0.001);注射铁总量与SI两者之间无相关(r=0.592,p=0.120)。Qdixon序列测定对照组和实验组家兔第5腰椎骨髓脂肪分数之间无差异(t=-1.895,p=0.088),第6脂肪分数之间有差异(t=-2.559,p=0.023);Histo序列测的对照组和实验组家兔第5、6腰椎骨髓脂肪分数之间无差异(t=-0.983,p=0.342、t=-482,p=0.637)。Qdixon序列测的16只家兔的第5、6腰椎脂肪分数与Histo序列测的相应腰椎脂肪分数均呈中度正相关(r=0.577,p=0.019、r=0.555,p=0.026);经原子分光光度仪测量骨髓脂肪含量与Qdixon、Histo测定的脂肪分数无线性相关(r=0.369,p=0.176、r=0.029,p=0.918),骨髓脂肪百分比与Qdixon测定的腰椎骨髓脂肪分数无线性相关(r=0.103,p=0.726、r=0.067,p=0.813),骨髓脂肪百分比与Histo测定的腰椎骨髓脂肪分数呈正相关(r=0.722,p=0.002、r=0.601,p=0.018)。原子分光光度仪测量的骨髓脂肪含量与病理腰椎骨髓脂肪百分比无相关(r=0.164,p=0.560)。结论:1.通过家兔后腿肌肉注射右旋糖酐铁可建立家兔腰椎骨髓铁过载模型;2.在家兔铁过载的状态下Histo序列可以准确定量第5、6腰椎骨髓脂肪含量。***序列测得的骨髓脂肪分数与Histo序列测得的骨髓脂肪分数呈正相关性。4.尚不能确定在家兔铁过载的状态下,Qdixon序列可以准确定量腰椎骨髓脂肪含量。

关键词： 新生儿   地中海贫血   全自动毛细管电泳   筛查   应用价值  

摘要： 目的 研究全自动毛细管电泳在新生儿地中海贫血筛查中的应用价值,为遗传咨询、早期干预治疗及防控地贫提供依据.方法 选取2018年1月至2018年4月北流市人民医院收治的1842例新生儿作为研究对象,在所有足月新生儿娩出后采集脐带血抗凝后送到实验室进行检查,并记录详细结果.结果 通过对北流市人民医院的1842例新生儿脐带血进行电泳分析,结果显示:HB bart’s的阳性例数为177例,占总新生儿的9.61％,疑似α地中海贫血表型有177例(9.61％),HbA＜10％,HbF＞90％,HbA2＞1％为表型的疑似β地中海贫血有115例(6.24％),HbE阳性带1例.结论 全自动毛细管电泳技术具有结果直观、准确率高、操作简单等优点,可以有效筛查地中海贫血,临床价值较高.

关键词： 地中海贫血   联合探针锚定聚合测序   国产高通量测序平台   核酸片段分离  

摘要： 地中海贫血在东南亚、地中海等沿海地区携带率高,是目前世界上发病率最高的遗传性溶血疾病。其致病基理为α或β珠蛋白链单一或复合的结构异常或合成异常导致的遗传性贫血。从对应的基因层面上讲,是由于α珠蛋白和β珠蛋白的编码基因(HBA1、HBA2和HBB)序列发生突变或缺失等变异所致,该基因变异可以通过测序的方法来检测并确诊。基于边合成边测序的NGS法成本低,检测通量高,是目前应用最广泛的方法。而市面上主流的NGS平台如Hiseq、Miseq系列测序仪器及配套试剂,其供应、技术及成本等均受限于国外,其临床应用不利于大规模地中海贫血的筛查。本文主要研究一款基于联合探针锚定聚合测序技术的国产自主研发的第二代测序平台MGISEQ-2000在地中海贫血基因检测中的应用。在一般的目的片段扩增及建库方法的基础上,使用329例已知结果的地中海贫血样本进行研发,优化了引物及实验检测流程,建立了信息分析方法。最后使用该方法检测了2000份经Hiseq-2500平台检测过的样本,分析该方法的性能。研究结果如下:1)通过对地中海贫血基因各类变异型序列的比对研究,重新设计了一系列用于扩增地中海贫血突变型与缺失型目的基因片段的引物,使用琼脂糖凝胶电泳法确认目的基因片段的大小与预期一致,通过Sanger测序验证了所设计引物的准确性。2)将329已知结果的样本扩增与建库后,使用核酸片段分离的方法以及使用联合探针锚定聚合测序法,对下机数据进行过滤分析,结果显示将不同大小的核酸片段进行分离,能实现其DNB(DNA Nanoball)大小不同片段拷贝数的相对均一化,测序信号强度相对一致,提高数据分布的均一性,目的区域深度覆盖效果较好;同时,本研究还建立了信息分析的阳性参考值,从而确定了该平台下的地中海贫血基因检测技术。3)本研究同时使用联合锚定探针测序技术和Hiseq平台对2000份样本的地中海贫血基因进行检测与分析,结果表明,两种检测方法对2000份地中海贫血筛查样本的检测结果一致,各种类型的地中海贫血变异均能检出,挑选各种类型的阳性样本进行Sanger与Gap-PCR进行验证,结果与预期相符,进一步从侧面证明本方法的可行性和准确性。综上所述,本研究基于联合探针锚定聚合测序技术成功建立了地中海贫血基因检测技术。核酸片段分离技术能给其他基于PCR扩增产物直接建库方法提供一种新的检测思路。该检测系统属于自主研发的国产化的测序系统,具有高通量高准确率,且成本可控的优势,有广泛的临床应用前景,适用于大样本量的实验室检测。

关键词： 重型β地中海贫血   造血干细胞移植   血清铁蛋白  

摘要： 目的：　　β地中海贫血(简称β地贫,Beta thalassemia)是一组因β珠蛋白基因缺陷造成的溶血性贫血.临床上根据β地贫贫血的严重程度将疾病分为轻型、中间型及重型.规范化终生输血及祛铁治疗是目前重型β地贫的主要治疗方法.而造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是目前临床上根治重型地贫的唯一途径.本中心从HSCT后白细胞及血小板的植入、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)、供者细胞嵌合等方面对移植后进行监测.铁负荷是移植前风险评估的重要项目,而血清铁蛋白(serum ferritin,SF)则是目前反映机体铁负荷状况最简单实用的方法.目前移植前血清铁蛋白对β地贫患者移植影响的研究仍存在争议.本研究主要阐述移植前血清铁蛋白对重型β地中海贫血移植的影响.　　方法：　　本中心对2014年7月至2018年12月60例在我中心行外周血造血干细胞移植的重型β地中海贫血病例进行了一项回顾性研究.所有病例均于移植后定期监测其白细胞及血小板植入时间、GVHD、供者细胞嵌合等指标.按移植前SF值将本研究入组病人分为高铁蛋白组(≥1500μg/L)和低铁蛋白组(＜1500μg/L)两组.使用卡方检验、Fisher检验、Mann-Whitney U检验及独立样本t检验等统计方法分析移植前血清铁蛋白与重型β地贫移植之间的关系.　　结果：　　1.造血干细胞移植前血清铁蛋白水平的中位数是1647.5μg/L,范围为453.6-4960.0μg/L.　　2.高、低铁蛋白组在白细胞及血小板的植入时间、急慢性GVHD发生率上并无显著的统计学差异(P=0.426,P=0.307,P=0.434,P=0.221).　　3.60例病例中全血混合嵌合发生率为18.33%,持续全血混合嵌合发生率为6.67%.当移植前血清铁蛋白≥1500μg/L时,有更高的全血混合嵌合发生率(P=0.016).　　4.高铁蛋白组比低铁蛋白组具有较高的T细胞混合嵌合发生率(P=0.046),而B细胞、NK细胞则无明显差异(P=0.137,P=0.224).同时研究了T细胞嵌合的影响因素.单因素分析示移植前SF与T细胞混合嵌合发生有关(P=0.046),但是多因素分析未见统计学意义(P=0.172).提示移植前铁蛋白浓度并非HSCT后第14天T细胞混合嵌合的独立危险因素.　　结论：　　1.移植前血清铁蛋白与白细胞及血小板的植入时间、急慢性GVHD发生率无关.移植前血清铁蛋白可能不是评估移植前全身铁过载可靠的临床指标.　　2.移植前血清铁蛋白与全血及T细胞混合嵌合发生率有关.

关键词： 血液检验   诊断价值   地中海贫血   缺铁性贫血  

摘要： 目的:探究血液检验在地中海贫血和缺铁性贫血中的诊断价值。方法:随机选取2017年1月与2018年1月于我院接受治疗的70例贫血患者,并按照血液检验结果将其分为地中海贫血组与缺铁性贫血组,每组各35例。对两组患者的血液检验指标进行观察记录和比较。结果:地中海贫血组的红细胞数量、平均红细胞体积、血红细胞分布宽度要显著低于缺铁性贫血组;而血红蛋白、平均血红蛋白浓度、平均红细胞血红蛋白量要显著高于缺铁性贫血组,差异具有统计学意义,P<0.05。结论:血液检验能够有效地辅助地中海贫血、缺铁性贫血的鉴别,具有一定的诊断价值。推荐在临床上推广使用。

关键词： β地中海贫血   沙利度胺   胎儿血红蛋白   疗效   安全性   数量性状基因座  

摘要： 目的:多中心研究沙利度胺治疗β地中海贫血患者的有效性和安全性;探讨HBG2、BCL11A和HBS1L-MYB基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)对其疗效的影响。方法:在中国南方三个临床研究中心招募无法进行常规输血和螯合治疗的β地中海贫血患者。我们评估了使用沙利度胺治疗的短期(3个月)和长期随访(12个月和24个月)的疗效和安全性。对本研究中心因无法进行常规输血和螯合治疗而使用沙利度胺治疗的β地中海贫血患者的疗效反应进行回顾性研究,应用聚合酶连式反应(polymerase chain reaction,PCR)及DNA测序技术对HBG2(rs7482144)、BCL11A(rs11886868、rs4671393、rs766432、rs1427407)和HBS1L-MYB(rs9399137、rs4895440、rs4895441)8个位点多态性分型,分析其与沙利度胺临床反应的关系。结果:患者的总体有效率(overall response rate,ORR)为93.5%,短期随访的主要反应者(main responder,Ma R)和次要反应者(minor responder,Mi R)率分别为62.9%和30.6%。在非输血依赖性地中海贫血(non-transfusion-dependent thalassemia,NTDT)患者中,治疗后血红蛋白(hemoglobin,Hb)水平从基线平均6.8±1.1g/dl增加到9.7±1.9g/dl(P<0.001)。Hb升高主要归因于胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,Hb F)水平的升高。在输血依赖型地中海贫血(non-transfusion-dependent thalassemia,TDT)患者中,在平均Hb水平增加的同时,观察到43.5%(10/23)的患者脱离输血,52.2%(12/23)的患者输血减少50%以上。平均每年输血量从20.7±7.7个单位显著下降到5.8±6.8个单位(P<0.001)。在平均随访14.6±9.6个月(3-37个月)后,这两组患者的反应仍然可以维持。除了一名患者出现周围神经毒性,未观察到其他严重药物相关不良反应的发生。Logistic回归分析表明基线Hb F比率(P=0.038,OR=1.111,95%CI:1.006-1.226)是沙利度胺主要反应的独立危险因素。在Ma R组中HBG2 rs7482144(P=0.015),HBS1L-MYB rs9399137(P=0.029)、rs4895440(P=0.040)和rs4895441(P=0.040)次要等位基因频率明显高于Mi R+NR组。同样在高Hb组中,这4个SNPs的次要等位基因频率明显高于低Hb组(P值分别为0.001、0.027、0.045和0.045)。在NTDT患者中,随着rs7482144(P=0.011)、rs9399137(P=0.013)、rs4895440(P=0.011)和rs4895441(P=0.011)相关次要等位基因数量的增加,治疗后Hb增量显著升高。这些贡献等位基因对沙利度胺反应有着累积效应。与没有贡献等位基因的患者相比,携带1或3个次要等位基因的患者的沙利度胺主要反应比率逐渐增加(P=0.040-0.018,OR=8.556-11.000)。此外,当评估NTDT患者中4个贡献SNPs的次要等位基因的累积数量时,Hb增量会随着次要等位基因数量的增加而增加(P=0.001)。结论:沙利度胺对β地中海贫血患者具有显著的治疗效果,且疗效反应可以长期维持。周围神经毒性是令人担心的。虽然这些初步结果支持沙利度胺作为β地中海贫血治疗药物具有长期疗效,但在临床应用前仍有一些问题需要解决。HBG2和HBS1L-MYB的SNPs与中国南方β地中海贫血患者的沙利度胺反应密切相关,并且这些SNPs上的次要等位基因的累积数目可以作为该人群中疗效反应的更好的预测指标。

关键词： CRISPR/Cas9   SEA型α-地中海贫血   体外转录sgRNA   淋巴母样细胞系   质控品  

摘要： α-地中海贫血是一种常染色体单基因遗传病,是一种由基因突变导致珠蛋白结构异常、血红蛋白(hemoglobin,Hb)组成成分异常的慢性溶血性贫血。东南亚型(southeast Asia,SEA型)地中海贫血是α-地中海贫血中占比最多的类型,其遗传学特征为一条染色体上两个拷贝的α-珠蛋白基因均缺失。Hb Bart's胎儿水肿综合征是α-地中海贫血中严重的致死性疾病。当夫妻双方均为SEA型α-地中海贫血患者时,怀孕后的胎儿则存在25%的概率为Hb Bart's胎儿水肿综合征,不仅导致胎儿无法存活,还对孕妇的生命具有较大威胁。因此应加强对SEA型α-地中海贫血的检测以及其胎儿的产前检测。针对SEA型α-地中海贫血早期的检测方法包括全血细胞计数,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)以及血红蛋白电泳。近30年来,多种分子遗传学检测方法,如DNA印迹杂交和DNA测序可以准确地检测大多数α-珠蛋白基因的变异,从而诊断α-地中海贫血。然而,这些方法由于操作繁琐且成本昂贵,不适用于进行所有α-地中海贫血病例的诊断。快速的筛查方法如跨越断裂点的PCR技术(gap-PCR)现已广泛应用于7种常见的缺失型α-地中海贫血的检测。实验室为了保证检测结果的准确性,在日常检测前需对商品化试剂进行性能验证(verification),厂家在进行方法研发时,需采用阳性样本进行性能确认(validation)。实验室在日常检测中,要进行室内质量控制(internal quality control,IQC)、参加室间质量评价(external quality assessment,EQA)/能力验证(proficiency testing,PT),而这些过程都离不开质控品。通常的遗传病检测质控品可分为以下三类:第一,非细胞类质控品,如人工合成的质粒;第二,采用患者细胞构建的永生化细胞系;第三,通过基因编辑技术在正常细胞系的基础上导入目的突变获得的细胞系。但是前两种类型的质控品存在一定的局限性,如非细胞类质控品缺乏细胞基因组DNA(genomic DNA,gDNA)的提取过程;永生化的患者细胞类质控品,其所包含的突变类型较少。而通过基因编辑技术制备的质控品,不但能包含更多的突变类型,也能模拟真实样本。目前,已有研究将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于质控品的制备,但是这些研究采用的细胞系均为贴壁细胞系,尚无采用淋巴母样细胞系进行质控品制备的研究,而国际公认母亲/父亲/儿子正常家系(CEPH/UTAHPEDIGREE 1463亲子细胞系GM12878/GM12877/GM12884)中的细胞系多为淋巴母样细胞系。因此,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对淋巴母样细胞系进行突变细胞系的构建有利于在国际公认亲子细胞系中构建同种类型的突变,从而不仅可以制备出针对SEA型α-地中海贫血检测的质控品,而且可以通过亲子细胞系的配对和酶消化的方法产生匹配的母体和胎儿游离DNA(cell free DNA,fDNA),从而可以为今后α-地中海贫血无创产前检测质控品的制备打下基础。本研究中,我们以稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系为基础细胞系,根据SEA型α-地中海贫血基因突变中16号染色体上存在19kb的DNA片段缺失的特点,针对其在16号染色体上缺失片段的两个断裂位点设计两种不同的单链引导RNA(singleguide RNA,sgRNA),并在体外通过pX458重组质粒对sgRNA进行转录和纯化,将纯化好的sgRNA通过电转染的方式导入稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系中,以制备具有SEA型α-地中海贫血基因突变的细胞系。我们同时也进行了直接转染pX458重组质粒(可表达Cas蛋白和sgRNA)至普通的GM12878细胞系的研究,并比较了二者的编辑效率。对最终编辑成功的细胞系进行了gap-PCR验证、Sanger测序验证以及全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)验证。结果显示将体外转录纯化后的sgRNA经电转染至稳定表达Cas9蛋白的GM12878细胞系相对于直接电转染pX458重组质粒至普通的GM12878细胞系是一种更有效的基因编辑方式。编辑后的单克隆细胞经gap-PCR验证的电泳结果显示在预期位置出现了电泳条带,即与SEA型α-地中海贫血的电泳条带位置相同。gap-PCR验证阳性的单克隆细胞PCR扩增产物经Sanger测序验证结果表明,在16号染色体上形成了 19kb左右的缺失突变,与SEA型α-地中海贫血基因突变缺失位置相同。但是在断裂位点处存在1 0bp左右的短片段插入或缺失突变(insertion and deletion,InDel),这相比于

关键词： 基因编辑   β-地中海贫血   γ-珠蛋白   造血干/祖细胞  

摘要： 基因编辑技术因其可以直接对基因组进行改造而被广泛应用于单基因遗传病治疗的研究中。β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因突变造成的,通过提高红细胞内的γ-珠蛋白的表达可以减轻β-地中海贫血患者的症状。有研究表明,利用慢病毒载体递送CRISPR/Cas9系统靶向CD34+造血干/祖细胞中γ-珠蛋白基因的启动子区,模拟遗传性胎儿血红蛋白持续存在症病人中天然存在的γ-珠蛋白基因启动子区-102到-114之间13bp的缺失,可以破坏转录抑制因子BCL11A在γ-珠蛋白基因启动子区的结合位点,进而提高细胞内γ-珠蛋白的表达水平,但是这种方法并不利于临床转化,一是因为慢病毒载体在人的造血干细胞中的转导效率低,二是因为慢病毒载体的随机整合会有潜在致瘤风险,而且Cas9蛋白的持续表达可能增加脱靶风险。为了能够创建直接用于临床的β-地中海贫血基因编辑基因治疗的技术平台,在本课题中,我们探究了Cas9蛋白在人的CD34+造血干/祖细胞中高效编辑的条件。我们发现,通过合成针对γ-珠蛋白基因启动子区-102到-114位点的sgRNAs,并对其两端进行了化学修饰,利用电穿孔将Cas9蛋白和经化学修饰的sgRNA-1以核糖核蛋白复合物的形式递送到β-地中海贫血患者来源的CD34+造血干/祖细胞中进行编辑,在无分选的情况下,CD34+细胞中的平均编辑效率可以达到80%以上。经过红系分化,编辑后的细胞内γ-珠蛋白mRNA相对于α-珠蛋白mRNA的平均表达水平可提高至126%,γ-珠蛋白链相对于α-珠蛋白链的平均含量可提高至64%,脱核率也提高至接近正常人的CD34+造血干/祖细胞红系分化后的细胞脱核率,而且不会产生脱靶效应。这些结果表明CRISPR/Cas9系统核糖核蛋白的递送方式可以高效编辑CD34+造血干/祖细胞的同时避免了慢病毒载体所带来的安全隐患。CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑的本质是产生双链断裂,为了开发一种不依赖双链断裂的β-地中海贫血的基因编辑疗法,我们尝试利用碱基编辑器hA3A-BE3来破坏BCL11A在γ-珠蛋白基因启动子区的结合以提高γ-珠蛋白的表达,通过电穿孔将密码子优化的hA3A-BE3蛋白和sgRNA-2递送到β-地中海贫血患者来源的CD34+造血干/祖细胞中,使γ-珠蛋白基因启动子区-114和-115处的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,虽然编辑效率只有大约15%,但是相对于未编辑细胞,编辑后的细胞内γ-珠蛋白mRNA相对于α-珠蛋白mRNA的平均水平至少提高了6.5倍。综上所述,本研究优化了CRISPR/Cas9靶向γ-珠蛋白基因启动子区以治疗β-地中海贫血的编辑体系,从概念上证明了碱基编辑技术可以用于诱导γ-珠蛋白的表达,为β-地中海贫血的基因治疗提供了新的参考。

关键词： 脱落滋养层细胞   单细胞分析   内质网染色   地中海贫血   单基因性疾病  

摘要： 研究背景与目的母体产道中的脱落胎儿细胞由于含有完整的细胞结构以及胎儿的整套基因组信息,而在非整倍体疾病、染色体微缺失、单基因性疾病以及新生儿溶血病等遗传性疾病的无创产前诊断中发挥着重要的作用。然而,脱落胎儿细胞的分离与鉴定仍缺乏快速、有效的检测方法;此外,目前尚缺乏对这些稀有细胞进行充分的胎源性验证;另外,目前这些稀有胎儿细胞在单基因性疾病的产前诊断应用仍需探究。因此,在本课题中,我们将建立一种快速、简便、有效的方法,用于脱落滋养层细胞的鉴定与分离;同时,我们将单细胞分离的胎儿细胞进行深入的、多位点的胎源性验证;在第三部分中,我们还将这些稀有细胞运用于地中海贫血的产前诊断中,并通过高通量测序分析,从而评估其在地中海贫血等单基因性疾病中的应用。研究方法1.通过ddPCR与qPCR评估脱落胎儿细胞的数目;通过显微镜荧光定量与流式细胞术等评估滋养层细胞与母体细胞差异,建立脱落滋养层细胞新型鉴定方法(内质网染色结合线性判别分析,ER-LDA);评估ER-LDA在细胞系模型与临床标本中的检测效果。2.通过单细胞分离,获取滋养层单细胞;通过免疫荧光分析脱落滋养层细胞的蛋白标志物表达情况;通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析,验证这些稀有细胞的胎源性。3.收集多个α地中海贫血与β地中海贫血孕妇病例样本,利用稀有滋养层细胞对相应的突变位点进行检测与分析;qPCR检测母体DNA与稀有滋养层细胞RHD分型,评估其用于新生儿溶血病产前检测的可能性;稀有滋养层细胞进行全外显子测序(whole exome sequencing,WES)分析,评估其在检测其他单基因性疾病致病位点中的可行性。实验结果1.脱落滋养层细胞个数约为72-5150个;内质网染色后滋养层细胞的荧光强度约为鳞状上皮细胞的3.13±1.13倍,为白细胞的2.64±0.73倍;通过ER-LDA分析,可在细胞模型中获取敏感性为99.0%、特异性为98.75%、准确性为98.83%的滋养层细胞的鉴别能力;另外,通过ER-LDA获取的单细胞基因组扩增覆盖度良好。2.通过ER-LDA分离临床标本中的滋养层细胞具有多个共同特征;均为HLA-G表达阳性或β-hCG阳性;FISH以及SRY-PCR检测候选男胎细胞可观察到Y染色体阳性信号;19个STR与22个SNP位点分析表明这些稀有细胞为胎儿来源性。3.稀有胎儿细胞可成功用于--SEA地中海贫血、-α4.2地中海贫血、多种β地中海贫血类型的突变检测,其检测结果与有创穿刺检测结果一致;通过稀有胎儿细胞RHD基因分型推测的RHD型别与血清型结果一致;稀有滋养层细胞WES分析可获取大量与疾病相关的变异位点,表明其可用于其他单基因性疾病突变位点的筛查与检测。结论我们成功地建立了一种新的、快速、有效的滋养层细胞鉴定方法,通过单细胞分离获取的稀有滋养层细胞具有完整的胎儿基因组,可用于多种地中海贫血亚型的产前诊断、RHD基因分型以及其他单基因性疾病的产前诊断。